CLU-His蛋白对Aβ寡聚化影响的单分子动力学性质研究

发布时间：2017-11-04 14:30

  本文关键词：CLU-His蛋白对Aβ寡聚化影响的单分子动力学性质研究

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【摘要】：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)俗称老年性痴呆,作为中枢神经系统一种常见的神经退行性疾病,以细胞外老年斑(Senile plaques, SPs)和细胞内神经纤维缠结(Neurofibrillary tangles, NFTs)为主要病理特征。以Aβ的胞外聚集为核心的Ap假说仍是当前公认度最高的AD发病机制学说,其中Ap寡聚体,被认为是主要的致病因子。Clusterin蛋白作为Ap的胞外分子伴侣,在体内和体外实验中均已被证实与Ap有直接相互作用关系,但二者之间相互作用机制尚不明确,且目前报道的研究结果也多有矛盾观点。因此,研究clusterin与Ap寡聚体间的相互作用并探讨其作用机制,对进一步揭示AD的发病机制及发现新的临床干预措施都有重要意义。双色荧光交叉关联光谱(Dual color-fluorescence cross correlation spectroscopy, DC-FCCS)是通过测量荧光强度随时间的涨落而进行分析检测的单分子荧光检测技术。DC-FCCS可检测两种不同的荧光组分,非常适合于生物大分子间相互作用的研究,应用DC-FCCS技术在单分子层面探讨clusterin与Ap寡聚体间的相互作用机制研究是我们首次提出。在本论文中,我们建立了相较于前期工作更为简单的荧光检测平台,构建了不携带荧光标签的CLU-His蛋白,并且CLU-His蛋白也无需体外荧光标记,只需将CLU-His蛋白与两种不同荧光标记的Aβ4z单体孵育,即可采用DC-FCCS技术对CLU-His与Aβ4z间相互作用的动力学行为进行观察。本论文采用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统进行CLU-His蛋白的真核表达,扩增clusterin编码序列,然后将其连接到pFastBacl载体上,并在C端连接His标签编码序列,获得pFastBacl-CLU-HIs质粒；将质粒转化到E.coli DH10Bac感受态获得重组DNA分子rBacmid-CLU-His；之后将rBacmid-CLU-His转染Sf9细胞,包装病毒并扩增,过表达CLU-His蛋白；CLU-His蛋白经镍柱和凝胶过滤两步柱层析纯化后,与分别标记Bodipy FL和ATTO 647N两种荧光染料的Aβ42单体,共同孵育,应用DC-FCCS监测CLU-His与Aβ42间相互作用的动力学行为。实验结果显示,Aβ42寡聚体和CLU-His之间有直接的相互作用；并且随着时间推移,二者的结合效率均逐渐增强；CLU-His对Aβ42寡聚体的形成具有明显的促进作用。本论文建立的荧光检测平台,不仅能够用于不携带荧光标签及无需体外荧光标记蛋白与Aβ42寡聚体间的相互作用研究,而且为探索AD的发病机制、药物靶标筛选、临床诊断及治疗研究提供更多的理论与实验依据。
【学位授予单位】：北京交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.16

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本文编号：1139822