抗Aβ单链抗体的杆状病毒表达及其干预Aβ体外聚集的机制研究

发布时间：2017-12-25 17:25

  本文关键词：抗Aβ单链抗体的杆状病毒表达及其干预Aβ体外聚集的机制研究　出处：《北京交通大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种常见的衰老相关的痴呆,在全球有3560万以上的老人患病。β-淀粉样蛋白(β-Amyloid peptide, Aβ)的错误折叠和聚集是AD的主要病理特点之一。通过之前的研究,本实验室已成功获得Ap寡聚体偏向的具有潜在治疗作用的单克隆抗体A8。为了进一步研究其作用机制,本研究拟构建和表达A8的单链抗体(single chain variable fragment, scFv),并研究其对Aβ聚集-解聚的干预作用和机制。 方法：1)scFv的表达、纯化和鉴定。根据之前克隆得到的A8单抗轻重链可变区序列,设计引物,分别在氨基和羧基末端引入组氨酸(His)标签,构建重组表达杆粒；之后通过转染Sf9细胞进行scFv的表达,采用镍亲和层析柱进行纯化；通过Western blot鉴定表达产物和纯化蛋白的分子量,通过斑点印迹和间接ELISA等方法对scFv的抗原识别能力进行初步鉴定。2)构建Aβ体外聚集的透射电子显微镜(transmission electron microscopy, TEM)测试实验体系。在不同时间点进行取样,对样品进行负染之后通过TEM对Ap的聚集情况进行测试分析。3)单链抗体对Aβ聚集的双向干预。在体外相变模型的体系中,分别研究scFv对Aβ聚集反应的抑制和对已经形成的纤维的降解作用。首先,将Aβ单体与scFv置于选定的反应体系中进行孵育,分别用反应缓冲液和A8单抗做为对照,观察与时间相关的纤维的形成状况,研究scFv对纤维形成的抑制作用。然后,选择不同的scFv浓度,研究其抑制作用的剂量依赖关系。最后,在已经形成的Aβ纤维样品(生长48h的纤维)中加入scFv继续进行孵育,以scFv缓冲液做为对照,研究scFv对已经形成的纤维的降解作用。 结果：1)在杆状病毒体系中,成功表达和纯化了带有His标签的scFv, Western blot结果表明其分子量为30kDa左右,与预期大小一致；斑点印迹和间接ELISA的结果表明所得scFv能够识别Aβ寡聚体抗原。2)确立Aβ体外相变模型并优化了其反应参数,确定最适合的缓冲液是硼酸缓冲液(pH8.5)；在没有Aβ预聚集的情况下,37℃孵育很快就有短纤维形成,约200nm；24h后长度平均约500nm,在孵育48h之后即可形成明显的较长的Aβ纤维,平均1μm；随着时间的推移,纤维的长度和直径逐渐增加,在96h后会有缠结的纤维形成。3)证实scFv对Aβ体外聚集的抑制作用。在加入scFv的实验组中,纤维的长度明显较同时间的对照组更短(p0.01),表明scFv可以有效的抑制纤维的形成。在已形成的纤维中加入scFv后,作用48h,与缓冲液及单抗对照组相比,长纤维明显变短(p0.01),提示scFv能够降解事先形成的纤维。在剂量依赖性研究中,可以看到10倍摩尔比的scFv能够起到抑制纤维形成的作用(p0.01),而1倍和5倍摩尔比的scFv对纤维形成的抑制效果并不明显。 综上所述,杆状病毒体系表达的抗Aβ scFv可以有效的抑制Aβ的聚集并对已经形成的纤维有一定的降解作用,而scFv的作用具有量-效依赖关系。本研究为进一步研究抗体参与的Aβ聚集-解聚的作用机制及相关抑制剂的开发提供了一定的实验依据。
【学位授予单位】：北京交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R749.16

【参考文献】

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1 史宝和;李玉锋;李成洋;师卫;陈晓虹;;石杉碱甲治疗轻中度阿尔茨海默病的临床研究[J];实用药物与临床;2013年01期

2 孙禹尧;;阿尔茨海默病中Aβ聚集的研究进展[J];中国老年学杂志;2013年12期

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本文编号：1333761