中华眼镜蛇α-神经毒的纯化及其在nAChR纯化上的应用

发布时间：2018-02-20 15:49

  本文关键词： 中华眼镜蛇 神经毒素 烟碱型乙酰胆碱受体 层析　出处：《第四军医大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：【背景】蛇毒，是由蛇的毒腺分泌，含有多种天然的多肽组分，包括心脏毒素，神经毒素（neurotoxins，NTs），磷脂酶A2，蛇毒因子等。根据淀粉凝胶电泳[1]可将银环蛇神经毒素分成，β两类，其中-神经毒素作用于突触后膜，β-神经毒素作用于突触前膜。根据氨基酸组成的不同，又可将-神经毒素分为两类，Ⅰ类神经毒素由70-74个氨基酸组成，含5对二硫键，被称为长链神经毒素，与骨骼肌中的烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinicacetylcholine receptor，nAChR）亲和力非常高；Ⅱ类神经毒素中含有60-62个氨基酸，4对二硫键，被称为短链神经毒素，与nAChR的亲和力较Ⅰ类低。国际上通常从印度眼镜蛇（Naja naja naja）、泰国眼镜蛇（Naja najaSiamensis）或孟加拉眼镜蛇（Naja naja Kaouthia）的毒液中纯化-神经毒素，后者通常被称为眼镜蛇毒素（cobra toxin）[2]。由于眼镜蛇毒素与nAChR的亲和力适中，所以也通常用于nAChR的纯化。中华眼镜蛇（Naja naja atra）在我国南方广泛分布，在蛇园中也有大规模的饲养，其毒液价格便宜，但没有相关报道是否能以其毒液中的-神经毒素作为亲和配体纯化nAChR。所以，，我们尝试从中华眼镜蛇的蛇毒中分离纯化-神经毒素，以期获得足够量的毒素，用于nAChR的纯化，进而建立重症肌无力主动免疫动物模型。 【目的】从中华眼镜蛇粗毒中分离其-神经毒素组分，利用纯化的-神经毒素作为亲和层析的配基耦联至琼脂糖凝胶上，制备成-神经毒-琼脂糖凝胶作为介质，从大鼠骨骼肌中纯化nAChR。 【方法】采用凝胶过滤层析分离出蛇毒中的低分子量蛋白，并通过125I--银环蛇毒素（Btx）-nAChR结合抑制实验检测蛋白活性，选择活性高的蛋白进一步用阳离子交换层析纯化，逐步分离出眼镜蛇-神经毒，SDS-PAGE分析蛋白分子量大小和纯度；将纯化的-神经毒耦联至NHS-活化的琼脂糖凝胶上，作为介质结合大鼠骨骼肌肌膜提取物中nAChR，0.2mol/L卡巴胆碱将受体洗脱至羟基磷灰石层析柱上，并以250mmol/L磷酸缓冲液洗脱收集，以放射免疫沉淀法测收集的洗脱液中的125I-Btx结合活性。 【结果】成功纯化出有较强125I-Btx-nAChR结合抑制活性的眼镜蛇-神经毒（Cobra VⅡc），但较天然的-银环蛇毒素弱，其分子量约为7kDa；在浓度为0.18μg/0.5ml体系中，纯化的-神经毒125I-Btx-nAChR结合抑制率约为60%；纯化出的-神经毒纯度可达到90%。以纯化的-神经毒为配基制备的亲和介质，可吸附大鼠骨骼肌膜提取物中约84%的125I-Btx结合活性，且此活性可以被0.2mol/L卡巴胆碱洗脱。 【结论】用简单的液相色谱方法可从中华眼镜蛇毒中分离纯化-神经毒素，并且以此为配体从大鼠骨骼肌中提纯nAChR。
[Abstract]:[background] Snake venom, secreted by snake's venom gland, contains a variety of natural polypeptide components, including cardiac toxin, neurotoxin neurotoxin NTsN, phospholipase A _ 2, snake venom factor and so on. The neurotoxin acts on the postsynaptic membrane and 尾 -neurotoxin on the presynaptic membrane. According to the different amino acid composition, the neurotoxin can be divided into two categories. Class I neurotoxin is composed of 70-74 amino acids and contains 5 pairs of disulfide bonds. Known as long chain neurotoxin, it has high affinity to nicotinic acetylcholine receptor nAChRin skeletal muscle, and class 鈪

本文编号：1519352