外源性CCK-8对吗啡依赖及复吸的影响及其机制研究

发布时间：2018-12-06 07:43

【摘要】：阿片类物质能产生强效的镇痛作用,但同时也是一种具有滥用潜质的药物,长期使用将导致耐受和依赖等副作用。阿片类药物滥用使个体健康水平下降,社会犯罪率上升,给社会安定带来巨大的威胁,是法医毒理学重要的研究内容。我国当前的毒品滥用形势非常严峻,开发有效的戒毒药物具有深刻的现实意义和社会价值。阿片依赖是一种慢性复发性脑病,以强迫用药、不断增加药物摄入量和停药时出现戒断综合征为主要特征,其发生的确切机制还不清楚。最近研究认为,许多非阿片受体作用系统可能是阿片依赖防治中的重要靶点。胆囊收缩素(Cholecystokinin, CCK)是一种典型的神经肽,广泛存在于中枢和周围神经系统。其中,八肽胆囊收缩素(Cholecystokinin octopeptide,CCK-8)是中枢神经系统主要的存在形式,是迄今体内最强的抗阿片肽类物质。研究显示,CCK-8可以阻止阿片肽与其受体的结合；吗啡或内源性脑啡肽能使K+诱发的大鼠中枢黑质的CCK释放呈“负反馈”性增加；CCK受体拮抗剂可以有效的防治反复吗啡处理或电针镇痛引起的耐受。除了上述的抗阿片效应之外,CCK作为一种神经递质或调质,还可调节镇痛、认知、奖赏、学习和记忆等过程。CCK及CCK受体mRNA在药物奖赏效应相关的脑区均有分布,如额叶皮质、杏仁核、腹侧被盖区、伏隔核。基于以上特点,我们推断CCK系统可能参与药物奖赏过程。Mitchell等通过条件性位置偏爱实验(conditioned place preference, CPP)考察了CCK受体拮抗剂对吗啡奖赏效应的影响,并认为内源性CCK是吗啡诱导CPP表达的必要条件。还有研究发现CCK受体拮抗剂能抑制吗啡依赖的形成、减轻戒断症状,阻断可卡因和吗啡诱导的CPP表达及复吸。因此,内源性CCK系统在阿片类药物依赖过程中具有重要作用。有趣的是,我们发现皮下注射吗啡前给予外源性CCK-8慢性干预也可减轻纳洛酮引起的急性催促戒断症状,与CCK受体拮抗剂的作用一致。也有研究曾报道,激活CCK受体可以抑制吗啡耐受。上述结果提示外源性CCK-8的干预作用可能与内源性CCK并不相同,其作用机制尚不清楚。我们考虑这种矛盾的现象可能与CCK-8的量效关系以及CCK受体敏感性有关。另外,阿片依赖牵涉阿片受体、神经递质、神经肽、细胞内信号转导、离子通道、神经核团与神经回路、学习记忆和奖赏机制等许多方面。神经递质在药物成瘾过程中发挥了重要作用,是药物依赖及其戒断过程最根本的神经生物学机制之一。但是,有关CCK-8与神经递质之间的联系目前尚不明确,其在成瘾行为形成的长时程适应过程中的互相调节机制还需进一步研究。基于以上研究背景,本研究通过观察CCK-8对吗啡依赖细胞模型以及吗啡诱导的CPP动物模型的影响,从体外细胞水平及动物整体水平明确不同剂量的CCK-8对吗啡依赖和复吸的作用,并从CCK与阿片系统相互作用关系和神经化学方面进一步探讨其相关作用机制,为CCK-8在吗啡依赖防治方面的实际应用提供系统、可靠的理论依据。1外源性CCK-8对吗啡精神依赖及复吸大鼠的影响目的：通过建立条件性位置偏爱(CPP)实验模型,观察不同剂量的外源性CCK-8对吗啡诱导的CPP获得、表达、消退的作用,以评价外源性CCK-8对吗啡精神依赖的影响；并通过观察不同剂量CCK-8对CPP重燃及行为敏化的作用,评价外源性CCK-8对复吸过程的影响。方法：给予皮下注射10mg/kg吗啡或侧脑室注射不同剂量(0.01、0.1、1μg)的CCK-8后进行程序性训练7天,建立大鼠CPP实验模型(无偏设计),并观察吗啡及CCK-8本身是否能诱导CPP形成。然后,在皮下注射吗啡前给予侧脑室注射不同剂量的CCK-8(0.01、0.1、1μg)干预,观察CCK-8对CPP形成的影响；CPP表达测试前15min给予大鼠侧脑室注射不同剂量CCK-8(0.01、0.1、1μg)干预,且于CPP测试后自然消退10天,观察其对CPP的表达及消退的影响。为观察CCK-8对复吸过程的影响,在建立大鼠CPP模型后,自然熄灭10天,以皮下注射3mg/kg吗啡进行CPP重燃,并于重燃前侧脑室注射CCK-8(0.01、0.1、1μg),再次进行CPP测试。为观察CCK-8对行为敏化的影响,给予皮下注射10mg/kg吗啡7天,并自然消退10天,然后皮下注射3mg/kg吗啡激发,测试大鼠30min内运动总路程,建立大鼠行为敏化模型；并在表达期注射吗啡前15min各组大鼠分别给予侧脑室注射不同剂量CCK-8(0.01、0.1、1μg)观察其对行为敏化表达的干预作用。最后,侧脑室注射不同剂量CCK-8(0.01、0.1、1μg)后,测试大鼠30min内运动总路程,观察CCK-8对大鼠自发活动的影响。结果：①单独给予CCK-8(0.01、0.1、1μg, i.c.v.)不能诱导CPP,也不产生位置厌恶；②皮下注射吗啡(10mg/kg)前于侧脑室注射不同剂量的CCK-8(0.01、0.1、1μg)进行干预,能显著抑制吗啡诱导的CPP的形成,CPP得分显著降低；③1μg CCK-8可促进CPP的表达,使CPP得分显著增加,0.01、0.1μg CCK-8对CPP表达无明显影响；0.1与1μgCCK-8能明显抑制CPP的消退,而0.01μg CCK-8对CPP消退无明显影响；④皮下注射3mg/kg吗啡成功诱导CPP的重燃,并且1μg和0.1μgCCK-8有效抑制了小剂量吗啡重燃CPP的过程,0.01μg CCK-8对CPP重燃无明显影响；⑤0.1与1μg CCK-8可显著抑制行为敏化的表达,但0.01CCK-8对吗啡诱导的行为敏化过程无明显影响；⑥侧脑室注射1μgCCK-8可抑制大鼠的自发活动,30min内活动总路程明显降低。小结：本部分实验成功建立了大鼠CPP实验模型,并首次发现侧脑室给予不同剂量的CCK-8(0.01、0.1、1μg)可抑制吗啡诱导大鼠CPP的形成。同时,还发现CCK-8(0.1、1μg)可以抑制小剂量吗啡引起的CPP重燃；抑制吗啡诱导行为敏化的形成,提示外源性CCK-8对吗啡精神依赖及复吸过程均有显著的调节作用。2外源性CCK-8对SH-SY5Y细胞慢性吗啡依赖的影响及其相关受体机制目的：观察外源性CCK-8对吗啡依赖SH-SY5Y细胞模型的影响,并探讨外源性CCK-8作用的量效关系以及与CCK受体敏感性的关系。方法：应用RT-PCR技术检测SH-SY5Y细胞内μ阿片受体、CCK1受体、CCK2受体及内源性CCK的表达,确定SH-SY5Y细胞是否符合细胞模型建立的要求。用10μM吗啡作用于全反式维甲酸(retinoic acid, RA)分化6d的SH-SY5Y细胞48h,建立细胞吗啡依赖模型,并用10μM纳洛酮作用15min进行急性催促戒断,诱导"cAMP超射”,并以cAMP超射水平为评价指标,观察不同浓度的CCK-8及选择性CCK1/2受体拮抗剂对细胞吗啡依赖的影响。结果：①μ阿片受体、CCK1受体、CCK2受体及内源性CCK均在SH-SY5Y细胞内共同表达,可用于细胞模型的建立；②用10μM吗啡作用于RA分化6d的SH-SY5Y细胞48h后,cAMP含量明显增加,给予10μM纳洛酮催促戒断15min后,使SH-SY5Y细胞内cAMP含量进一步增加3.09±0.28倍,形成明显的cAMP超射状态,说明慢性吗啡依赖细胞模型建立成功。并且,慢性吗啡处理使CCK受体及内源性CCK表达显著上调；③1-10μM CCK2受体拮抗剂(LY-288,513)显著抑制了纳洛酮催促戒断引起的cAMP超射,而CCK1受体拮抗剂(L-364,718)对其无明显作用；④CCK受体激动剂CCK-8(0.1-1μM)与吗啡共同孵育细胞能浓度依赖性的抑制纳洛酮催促戒断引起的cAMP超射,并且这种作用可被CCK1受体拮抗剂翻转。因此,内源性CCK通过CCK2受体促进吗啡依赖的形成,而外源性大剂量CCK-8对吗啡依赖的抑制作用可能与CCK1受体有关。小结：本部分实验结果提示外源性CCK-8和内源性CCK对吗啡依赖过程的作用不同,且首次发现CCK1受体参与了外源性CCK-8抑制吗啡依赖的过程。 3CCK-8对内源性阿片系统的调节作用目的：通过观察不同浓度的CCK-8对吗啡依赖SH-SY5Y细胞模型内源性阿片系统的影响,初步探讨CCK-8与内源性阿片系统在吗啡依赖过程的相互作用及其机制。方法：提取大鼠脑组织及SH-SY5Y细胞膜蛋白,应用放射配基结合技术观察不同浓度CCK-8对μ阿片受体(MOR)结合特征的影响。应用Real-Time PCR技术检测SH-SY5Y细胞前脑啡肽原(PENK)、前阿黑皮质素原(POMC)基因的表达,观察不同浓度CCK-8对PENK、POMC表达的影响。建立吗啡慢性依赖SH-SY5Y细胞模型,检测CCK受体、内源性CCK以及内源性阿片肽原PENK、POMC表达的变化,并观察不同浓度CCK-8对吗啡处理后PENK、POMC表达变化的影响。结果：①大鼠脑组织μ阿片受体的Bmax值为82.9±7.2pmol·mg-1Pro, Kd值为1.38±0.05。CCK-8可以浓度依赖性地抑制大鼠脑组织中μ阿片受体与其配基[3H]DAMGO的结合,并可浓度依赖性的降低μ阿片受体结合反应的Bmax值,而对Kd值无明显影响；②RA分化6d后的SH-SY5Y细胞μ阿片受体的Bmax值为378.3±48.9pmol·mg-1Pro,Kd值为0.79±0.09。CCK-8可浓度依赖性地抑制SH-SY5Y细胞μ阿片受体与其配基[3H]DAMGO的结合,并且此抑制作用可被CCK1及CCK2受体拮抗剂(L-364,718,LY-288,513)翻转；③10μM吗啡作用于RA分化SH-SY5Y细胞48h后,内源性CCK系统明显上调,CCK1受体、CCK2受体及内源性CCK mRNA表达水平分别增加2.51±0.56、6.10±0.91和4.87±1.08倍；④10-10M-10-6M CCK-8孵育RA分化6d后的SH-SY5Y细胞48h后,结果显示10-7M、10-6M时可使PENK、POMC表达显著上调,并且这种作用可被CCK1受体拮抗剂L364,718翻转；⑤10μM吗啡处理RA分化6d的SH-SY5Y细胞48h后,PENK、POMC表达较正常组均明显下调,并且10-8、10-7、10-6MCCK-8与吗啡共同孵育可使PENK、POMC表达较吗啡组显著增加。小结：①低浓度(10-10、10-9M)CCK-8可通过激活CCK受体抑制SH-SY5Y细胞μ阿片受体的结合力,对PENK、POMC的表达无明显影响；②高浓度(10-8-10-6M)的CCK-8可使PENK、POMC基因表达增加,促进内源性阿片肽的释放,并可改善吗啡依赖后内源性阿片系统的失衡。 4CCK-8对SH-SY5Y细胞培养上清中单胺类及氨基酸类神经递质的影响目的：通过高效液相色谱质谱(LC-MS)技术检测SH-SY5Y细胞培养上清中DA、5-HT、NE、谷氨酸和GABA及其代谢产物的含量,并观察吗啡及CCK-8急性处理对培养上清中神经递质含量的影响,进一步阐明CCK-8调节吗啡成瘾过程的神经化学机制。方法：培养SH-SY5Y细胞,RA分化6d后更换为HBSS缓冲液孵育细胞,24h后加入相应的药物进行刺激,然后分别于10、20、40、60min各取出100μl上清液,样品处理后应用LC-MS检测DA、DOPAC、HVA、5-HT、5-HIAA、NE、MHPG、Glu、GABA九种神经递质及其代谢产物的含量,观察吗啡及CCK-8急性处理对培养上清中神经递质含量的影响。结果：①给予100μM吗啡孵育RA分化后SH-SY5Y细胞,分别于10、20、40、60min取出部分上清液进行LC-MS检测,结果显示细胞培养上清中单胺类神经递质DA、NE和5-HT及其代谢产物在10-20min内均显著下降,随后逐渐降低并保持在较低水平。同时,兴奋性氨基酸 (Glu)的释放也明显减少,而抑制性氨基酸(GABA)释放增加。表明激活阿片受体对神经元产生的直接作用是抑制性的；②给予100μM吗啡与10-6M CCK-8共同孵育细胞,发现培养上清中DA、NE、5-HT、Glu及其代谢产物的含量在10-60min内呈下降趋势,但是明显高于单独吗啡处理细胞上清液中的递质水平；GABA含量也有所上升,但明显低于单独吗啡处理细胞。说明CCK-8可以有效拮抗急性吗啡处理对细胞产生的抑制作用；③单独给予CCK-8急性处理SH-SY5Y细胞,结果发现CCK-8使细胞培养上清中DA及其代谢产物的含量降低,在20min左右时达最低水平,随后逐渐升高；并且CCK-8急性处理后,GABA含量升高、Glu含量降低,而NE、5-HT及其代谢产物的含量无明显变化。小结：本部分实验结果显示急性吗啡或CCK-8单独处理对SH-SY5Y细胞产生的直接作用是抑制性的,体现在两者可抑制单胺类神经递质(DA、NE、5-HT)及兴奋性氨基酸(Glu)的释放,增强抑制性氨基酸(GABA)释放；而CCK-8可拮抗吗啡急性处理产生的抑制作用,说明CCK-8可通过受体间的相互作用在神经递质水平发挥其“抗阿片”作用。结论：本文在细胞及动物整体水平系统研究了外源性CCK-8对吗啡依赖及复吸过程的作用,并探讨了CCK-8作用的相关受体及神经化学机制,观察了CCK-8与内源性阿片肽系统的调节作用。得出以下结论： 1侧脑室给予CCK-8(0.01、0.1、1μg)干预可抑制吗啡诱导大鼠CPP的形成。同时,还发现CCK-8(0.1、1μg)可以抑制小剂量吗啡引起的CPP重燃、抑制吗啡诱导行为敏化的形成,提示外源性CCK-8对吗啡精神依赖及复吸过程均有显著的调节作用； 2外源性CCK-8和内源性CCK对吗啡依赖过程的作用并不相同,内源性CCK通过CCK2受体促进吗啡依赖的形成,而外源性高浓度CCK-8通过CCK1受体发挥其抑制作用； 3低浓度(10-10、10-9M)CCK-8可通过激活CCK受体抑制μ阿片受体的结合力,但对PENK、POMC的表达无明显影响；高浓度(10-8、10-7、10-6M)的CCK-8可使PENK、POMC基因表达增加,促进内源性阿片肽的释放,并可改善吗啡依赖后内源性阿片系统的失衡； 4急性吗啡或CCK-8单独处理对SH-SY5Y细胞产生的直接作用是抑制性的,体现在两者可抑制单胺类神经递质(DA、NE、5-HT)及兴奋性氨基酸(Glu)的释放,增强抑制性氨基酸(GABA)释放；而CCK-8可拮抗吗啡急性处理产生的抑制作用,说明CCK-8可通过受体间的相互作用在神经递质水平发挥其“抗阿片”作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R749.6

【参考文献】