RNA氧化在阿尔兹海默病发病中的作用机制研究

发布时间：2019-05-15 09:19

【摘要】：阿尔兹海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种进行性、不可逆转的大脑(特别是皮层和海马)神经元损失的神经系统退行性疾病,以认知障碍、记忆损害和人格改变为主要临床特征。神经病理改变以细胞外老年斑(senile plaque,SP).脑细胞内tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)以及大量神经元丢失为主要特征。随着人口老龄化,AD患者数量急剧上升,明确AD的发病机理,对解决人口老龄化带来的一系列问题至关重要。作为老年斑的主要组成成分,β淀粉样蛋白(Amyloid β protein,Aβ)由淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein,APP)经β-和γ-分泌酶共同剪切形成。老年斑中Aβ主要以Aβ1-40和Aβ1-42两种形式存在,Aβ1-42从时程和量程上均表现出比Aβ1-40更强的毒性。 Aβ从产生、聚集、到发挥神经毒性要经历以下5个环节：APP基因→APPmRNA→APP蛋白质→Aβ多肽→Aβ多肽聚集。目前的研究认为,APP基因在DNA水平的变异是造成Aβ增加的重要原因,但这只能解释占AD总数1%左右的家族性AD(Familial AD,FAD)的发病机制,因为在绝大多数散发性AD(Sporadic AD)患者中,都未发现APP基因的变异。我们实验室长期从事RNA氧化与衰老相关疾病的分子机制研究。RNA氧化最主要的产物是8-氧化鸟苷(8-oxo-7,8-dihydroguanosine,8-oxoG),8-oxoG既可以与DNA模板上的胞嘧啶(Cytocine,C)配对,也可以与腺嘌呤(Adenine,A)配对,引起转录错误,产生序列变异的蛋白质,基因组DNA信息将不能准确的传递给蛋白质。 1999年,有研究者发现,AD患者大脑RNA氧化产物8-oxoG明显增高,且与病情进展有明确的相关性。为了验证这一结果,2008年,我们采用免疫组化方法开展了快速老化小鼠(Senescence-accelerated mice prone8,SAMP8)和其正常对照(Senescence-accelerated mice resistant1,SAMRl)鼠的大脑神经细胞中DNA和RNA氧化水平的研究。结果显示：SAM鼠大脑神经细胞DNA中8-oxodG和RNA中8-oxoG呈现增龄性增加,且同月龄的P8鼠高于R1。随后,我们完成了AD患者尸检海马组织的免疫组化研究,与同龄正常对照者相比,AD患者海马细胞核中8-oxodG含量和胞浆中8-oxoG含量均显著增加。免疫组化结果受实验者的主观影响较大,仅靠灰度定量,无法准确评估RNA氧化程度。本研究中,我们建立了准确度和灵敏度更高的高效液相色谱—三重四级杆质谱(LC-MS/MS)串联检测体系,并运用该体系检测了SAMP8和SAMR1小鼠各个脏器,包括大脑、肺、心脏、肝脏、肾脏和睾丸的DNA和RNA氧化水平,以及血浆和尿液中DNA和RNA氧化代谢物的浓度。我们的检测结果再次确认了核酸氧化,特别是RNA氧化与SAMP8鼠学习记忆能力下降的相关性。我们还发现,尿液8-oxoG的含量远高于血浆8-oxodG、血浆8-oxoG以及尿液8-oxodG,有可能是评价机体氧化损伤的较好的生物学标志物。基于此,我们假设：APP基因的mRNA因氧化而引起基因转录和翻译过程改变,造成APP蛋白的氨基酸序列改变。变异的APP蛋白经病理性的β、γ水解途径,产生更多种类和量的Aβ片段,继而聚集形成老年斑,启动AD的病理学过程。为了验证这一设想,我们在细胞水平开展了以下实验：在CHO细胞中稳定转染人APP基因,同时采用RNA干扰(RNAi)技术敲减RNA氧化抑制基因MTH1,成功构建CHO_APP_iMTHl单克隆细胞株。我们在此细胞培养基中添加8-oxoGTP (8-oxo-7,8-dihydroguanosine5-triphosphate,8-氧化鸟苷三磷酸)。在RNA转录过程中,8-oxoGTP可与GTP竞争性地掺入RNA链,引起RNA氧化增加。通过采用ELISA技术检测培养基中Aβ1-x、Aβ40和Aβ42的浓度,我们发现,RNA氧化使单个细胞分泌的上述3种多肽显著增加(P0.05)。借助MALDI-TOF和Q-TOF等质谱技术,我们观察了加压之后Ap在种类和量上的变化。将检测结果与Aβ野生型片段谱数据库比对,我们发现con组培养基中的Ap片段有69种,而oxo组培养基中的Ap片段有108种。通过内标校正定量,我们发现oxo组大部分Ap表达量都增加。同时,我们在动物水平开展了以下实验：我们以8月龄SAMR1和SAMP8小鼠为模型,分为R1con组和R1oxo组,P8con和P8oxo组。通过侧脑室和尾静脉注射纳米材料包裹的8-oxoGTP,造成全身各脏器,特别是大脑RNA氧化水平增加。注射2个月之后,我们观察了SAM鼠行为学指标(包括Morris水迷宫、新物体识别、平衡杆实验、旷场实验)的改变。结果显示：水迷宫实验中,注射8-oxoGTP的R1小鼠找到平台的潜伏期显著长于R1con组(P0.05),但P8鼠的con组和oxo组在水迷宫的测试结果上差别不明显。在新物体识别、平衡杆实验和旷场实验中,oxo组与con组的表现没有明显区别。该结果提示RNA氧化可引起R1鼠的空间学习记忆能力下降。由于P8鼠在检测时衰老程度已经非常严重,且受到其它疾病的干扰,导致检测结果无规律可循。综上,本研究在细胞水平发现RNA氧化增加导致Ap蛋白生成增多,在动物水平发现RNA氧化增加可导致学习记忆能力下降,表明RNA氧化所造成的变异蛋白产生可能是阿尔茨海默病的发病机制之一。目前动物实验还在进行中,我们计划在注射4个月之后,采用PET-CT观察AB斑块的形成情况。并采用免疫组化技术,观察大脑组织(特别是海马区)Aβ1-x、Aβ40和Aβ42的表达情况,从影像学和病理学两个方面进一步确定RNA氧化在Ap产生和AD发病中的作用。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R749.16

【参考文献】