Aβ相关乙醇脱氢酶阻断肽适配子对Aβ细胞内毒性拮抗作用的研究

发布时间：2019-07-29 12:36

【摘要】：阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是以慢性进行性认知功能障碍为特征的常见的神经系统退行性疾病，目前尚无有效预防及治疗手段。AD是引起痴呆的主要疾病。据研究估算，2010年全球约有3560万痴呆患者，此数量大约以每20年翻倍的速度增长，预计到2030年将有6570万痴呆患者，到2050年将有1.154亿人患有痴呆~([1])。AD的主要病理学特征为细胞外老年斑、细胞内神经元纤维缠结，以及神经元和突触缺失。淀粉样肽（amyloid β peptide，Aβ）是构成老年斑的主要成分。大量研究表明，A β是AD发生和发展的关键因素，因此阻断Aβ有可能成为有效的治疗靶点。 近来的研究表明，线粒体功能障碍与年龄相关性神经系统退行性疾病有关。线粒体功能障碍出现于AD早期，表现为能量代谢障碍，自由基产生增多，细胞内钙超载等。Aβ引起的线粒体结构异常和功能损伤在AD的发病过程中发挥重要作用。在过度表达突变APP的转基因小鼠和AD患者的脑内，A在线粒体中进行性聚集，对线粒体产生毒性作用。引起研究人员关注的是：线粒体内Aβ与Aβ相关乙醇脱氢酶（amyloid β binding alcoholdehydrogenase，，ABAD）的相互作用引起有害的中间代谢物的聚集，加重了线粒体损伤。A β相关乙醇脱氢酶阻断肽（ABAD decoy peptide，ABAD-DP）即ABAD的L_D拓扑结构环的92-120氨基酸区，含有能与Aβ结合的区域，外源性给予ABAD-DP可在线粒体内竞争性拮抗ABAD与Aβ的结合，保护线粒体的ABAD活性，可抑制或拮抗A β的细胞毒性作用。因此，ABAD-DP为治疗AD带来了希望，而如何合成能在细胞内稳定表达的，并可与Aβ高效结合的ABAD-DP成为在AD防治中亟待解决的问题。 本研究以肽适配子为基础，应用分子生物学技术，将ABAD-DP插入到人硫氧化还原蛋白（thioredoxin，TRX）的活性位点中间，构建TRX1-ABAD-DP-TRX2（T-A-T）融合基因，通过腺相关病毒实现适配子T-A-T的稳定表达；并通过体外实验，进一步验证适配子T-A-T对A细胞内毒性的拮抗作用，以期开发AD治疗的新途径。研究共分2个部分： 第一部分构建稳定表达A相关乙醇脱氢酶阻断肽适配子（TRX1-ABAD-DP-TRX2）的重组腺相关病毒 目的：利用分子生物学技术，构建稳定表达TRX1-ABAD-DP-TRX2（T-A-T）的重组腺相关病毒。方法：①通过PCR获得目的片段TRX1、ABAD-DP及TRX2，采用Sanger末端终止法测出全部的核苷酸序列，并进行酶切鉴定。进一步将上述3个目的片段按既定顺序插入腺相关病毒穿梭质粒pSSHG-CMV的多克隆位点，从而获得融合基因T-A-T，进行酶切鉴定。②经聚乙酰亚胺介导三质粒（pSSHG/T-A-T、pAAV/Ad及pHelper）转染HeLa细胞，回收得到重组腺相关病毒rAAV/T-A-T，用实时定量PCR法测定病毒滴度。③rAAV/T-A-T感染NIH-3T3细胞，行免疫荧光组织化学染色检测适配子T-A-T的表达。结果：①TRX1、ABAD-DP、TRX2的核苷酸序列与实验设计完全相符，基因片段长度分别为114bp、93bp、235bp，酶切鉴定结果也与理论值一致。T-A-T融合基因片段的大小约为435bp，与理论值相符。②重组腺相关病毒rAAV/T-A-T的滴度为3.45×10~8/ml。③rAAV/T-A-T感染NIH-3T3细胞后，免疫荧光组织化学染色显示90％以上的细胞呈现绿色荧光。结论：①成功构建了A相关乙醇脱氢酶阻断肽适配子T-A-T。②成功构建了表达T-A-T的重组腺相关病毒rAAV/T-A-T。 第二部分重组腺相关病毒rAAV/T-A-T对细胞内Aβ_(42)拮抗作用的研究 目的：利用AD细胞模型，验证表达适配子T-A-T的腺相关病毒（rAAV/T-A-T）对细胞内Aβ_(42)的拮抗作用。方法：①包装重组逆转录病毒rL42SN，建立细胞内表达Aβ_(42)的AD细胞模型，行免疫荧光组织化学染色检测Aβ_(42)的表达。②rAAV/T-A-T和rL42SN感染NIH-3T3细胞，行免疫荧光组织化学染色检测适配子T-A-T及Aβ_(42)在细胞内的定位。③用SH-SY5Y细胞进一步验证适配子T-A-T对细胞内Aβ_(42)的拮抗作用。分为4组：正常对照组、T-A-T组、A组及T-A-T+A组，加入相应病毒感染72h，显微镜下观察细胞形态学改变，进行MTT染色。结果：①rL42SN感染NIH-3T3细胞后，免疫荧光组织化学染色显示90%以上的细胞呈现红色荧光。②用免疫荧光组织化学染色方法检测到绿色荧光及红色荧光共同定位于NIH-3T3细胞质内。③显微镜下见SH-SY5Y细胞在正常对照组与T-A-T组状态良好，密度较高；A组细胞密度较低，状态不佳，可见大量细胞出现凋亡及坏死；T-A-T+A组，细胞状态明显好于A组。④MTT结果显示，与正常对照组相比，A组的细胞活力显著降低（p0.05），T-A-T组与正常对照组的细胞活力差异无显著性意义（p0.05），T-A-T+A组的细胞活力较A组明显增高（p0.05）。结论：①成功建立了细胞内高表达Aβ_(42)的重组逆转录病毒rL42SN。②适配子T-A-T能够与A42在细胞内结合。③适配子T-A-T可拮抗Aβ_(42)的细胞内毒性作用。
【图文】：

振的研究发现，ABAD与A 结合的位点位于LD拓扑结构环上，ABAD-A 复合物的形成阻止了ABAD与NAD+的结合，引起ABAD空间构像改变及活性丧失（图1.1） ，导致线粒体功能紊乱，进而增强了A 的毒性作用，即增加了活性氧的产生，提高了caspase-3活性，引起线粒体能量代谢异常，加重了AD转基因小鼠的空间学习能力和记忆力障碍及神经病理学改变 。ABAD活性的降低也影响雌激素的代谢，从而破坏雌激素的神经保护作用加重A 的毒性 。因此阻断ABAD与A 的相互作用可能成为潜在的AD治疗策略 。

特异性结合小分子代谢物，通过构象变化，在转录或翻译水平上调节表达。核糖开关广泛存在于细菌的代谢相关基因中，在真菌、植物中发现。此外，研究者从庞大的随机文库中筛选出与靶标高度结合的适。SELEX 是体外筛选适配子的重要手段，适配子的筛选方法随后被简自动的体外过程，为高通量的筛选开辟了道路 。SELEX 可以有效一个含有 1014-15个随机序列的复合核酸或核苷酸文库中筛选出一个或与靶标紧密结合的序列。通常，这些适配子-靶标复合体的解离常数（Kd高皮摩尔到低纳摩尔。筛选过程可概括为三个步骤：（1）选择与靶标的配基；（2）分离适配子与非适配子；（3）扩增适配子 （图 1.2）。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R749.16

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 杨宇,王全师,吴江,胡海涛,胡林森,杨广笑;通用腺相关病毒载体构建及表达报告基因GFP的研究[J];中风与神经疾病杂志;2004年01期

2 王旭;杨宇;吴江;;适配子技术在中枢神经系统疾病中的研究进展[J];中风与神经疾病杂志;2011年01期

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1 杨欣;稳定融合表达拮抗Aβ_（1-42）肽细胞内毒性的适配子策略及其作用机制的研究[D];吉林大学;2008年

2 王明宇;可分泌Aβ阻断肽的重组腺相关病毒的神经保护作用研究[D];吉林大学;2012年

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1 孙欣;细胞内非分泌表达淀粉样蛋白Aβ_（1-42）所致细胞毒作用的研究[D];吉林大学;2006年

本文编号：2520508