【摘要】：阿尔茨海默症(Alzheimer's disease, AD)是四大常见的神经退行性疾病之一。在65岁以上的人群中,大约10%患有AD。随着人口老龄化,这一疾病的危害愈加突出；此外AD还逐步呈现年轻化趋势。AD给患者及家属的生活质量带来很大影响,同时也给社会带来很大压力。AD的治疗已成为亟待解决的重要问题。 文献报道,多种蛋白多肽药物(如神经生长因子、脑源性神经营养因子、碱性纤维生长因子等)具有神经保护作用,为神经退行性疾病如AD的治疗带来希望。但是,这些多肽蛋白类药物的体内稳定性差,易受酶降解,血中半衰期短；并且由于血脑屏障的存在使得这类药物难以入脑,不能实现直接给药用于脑部疾病的治疗。因此对于蛋白多肽类药物脑内递释的研究具有很高的科学价值和临床意义。 为了增加药物透过血脑屏障,目前研究最为关注,也最具前景的策略是将纳米载药系统经受体介导胞吞转运入脑。但是目前报道的介导入脑的靶向功能基如转铁蛋白、胰岛素和OX26等都存在体内内源性蛋白饱和及竞争抑制问题,从而影响其介导入脑的效果。为了解决上述难题,本文采用噬菌体展示技术主动筛选新型的靶向功能基,并获得对小鼠脑部具有靶向性的噬菌体展示短肽TGN和CTY。该展示短肽具有低免疫原性、高靶向性和易于修饰的优点,并可以解决上述内源性饱和的问题。将筛选得到的噬菌体展示肽以共价连接的方式修饰到聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸共聚物(PEG-PLGA)纳米粒表面,由此构建新型的脑靶向递药系统。通过PEG-PLGA纳米粒包载蛋白多肽药物可以保护其不受体内环境降解,提高稳定性；纳米粒表面修饰的噬菌体展示肽可以发挥脑靶向作用而介导载药纳米粒入脑,提高对中枢疾病的治疗效果。 本文第一部分为噬菌体展示技术筛选脑靶向功能肽,实验选择两种噬菌体肽库进行体内亲和筛选。利用Ph.D.-C7C肽库,经过筛选方式和筛选条件的优化,在多轮体内亲和筛选后获得五个单克隆噬菌体。其中三个单克隆噬菌体展示相同的序列,为CTSTSAPYC,其重复率为7.14%；其余两个单克隆噬菌体展示另一条序列,为CPMKSHTNC,其重复率为4.76%。将前者命名为Clone7-19,将其展示的基序即CTSTSAPYC命名为CTY肽。同样,利用Ph.D.-12肽库筛选获得一条序列为TGNYKALHPHNG的展示肽,其重复率高达60%,将其命名为TGN肽,展示TGN肽的噬菌体命名为Clone12-8。CTY连接FITC后(FITC-CTY)的活体分布显示其具有较好的脑靶向性。Clone12-8在免疫组化小鼠体内分布考察和荧光标记后(FITC-TGN)的活体分布结果显示也具有良好的脑靶向性。但这两条展示肽都较易被肾排泄,难以有效发挥脑靶向效果。 为了使上述展示肽能在体内长时间发挥脑靶向性,第二部分进一步将展示肽与具有体内长循环特性的PEG-PLGA纳米粒相结合,共同构建一类新型、高效的脑靶向递释系统。第二部分第一章采用乳化/溶媒蒸发法制备普通纳米粒(Nanoparticle, NP),通过纳米粒表面PEG链末端的马来酰亚胺基团(Maleimide, MAL)与展示肽TGN末端的巯基共价反应,将展示肽结合到纳米粒表面(TGN-NP),并对TGN-NP制备中的若干条件进行了优化,确定以下条件：聚合物加入的总量为每份25mg, MePEG-PLGA与MAL-PEG-PLGA的比例为4：1,马来酰亚胺基与蛋白巯基的反应摩尔比为3：1,两者的反应时间为6-8h。按优化工艺制备的TGN-NP粒径在89nm左右,Zeta电位在—24mV左右,表面连接的TGN数目在195左右。利用纳米粒包载近红外染料DiR,通过小动物活体成像仪比较了NP、表面低密度修饰的TGN-NP (3:1)、高密度修饰的TGN-NP(1：1)以及高密度修饰的CTY-NP (1:1)尾静脉注射裸鼠后的活体分布及脑内递药特性。结果表明,TGN肽高密度修饰的纳米粒具有较好的脑靶向性,且显著优于CTY肽高密度修饰纳米粒、TGN肽低密度修饰纳米粒及NP,其能有效增加纳米粒的入脑量,而一定程度减少肝、肾等组织中的纳米粒聚集,有望作为脑靶向功能基介导更多药物入脑。 第二部分第二章对TGN-NP的脑内递药特性和毒性进行了体外评价。制备了载香豆素-6的NP和TGN-NP,体外泄漏实验证明,包载在NP和TGN-NP中的香豆素-6在pH4.0和pH7.4介质中的泄漏率均较低,提示可用于示踪纳米粒的体外行为。bEnd.3细胞摄取载香豆素-6的NP和TGN-NP的定性观察结果显示,在30、60、120min时,细胞对TGN-NP的摄取均显著高于NP。定量实验结果表明,bEnd.3细胞在不同纳米粒浓度、不同温度及不同时间条件下对TGN-NP的摄取均显著高于NP,且TGN-NP的摄取呈现时间、浓度和温度依赖性。说明bEnd.3细胞对于TGN-NP的摄取是一个主动转运过程。胞吞抑制实验提示,TGN肽对TGN-NP胞吞转运起着竞争抑制作用,TGN-NP主要通过穴样凹陷和巨胞饮两条途径被bEnd.3细胞内吞,并且该过程为高尔基体和溶酶体参与的能量依赖过程。细胞活力测定结果显示,在0.1～10mg/mL的浓度范围内, NP、TGN-NP和TGN为RGR的0～1级,具有良好的安全性。TGN-NP是一种有效、低毒的脑靶向药物递释系统。 第二部分第三章对TGN-NP的脑内递药特性进行了体内评价。建立了香豆素-6全血样品、组织样品测定方法,该方法专属性强,标准曲线的线性关系良好,精密度、回收率符合生物样品测定要求。小鼠尾静脉注射载香豆素-6的TGN-NP(剂量为50μg/kg香豆素-6)1h后脑切片的结果显示,TGN-NP在第三脑室、皮层及海马区域的分布均显著高于NP。以香豆素-6作为荧光探针,以NP作对照,采用药动学方法考察了TGN-NP (3:1)和TGN-NP (1:1)的脑内递药特性,ICR小鼠尾静脉注射TGN-NP (3:1)和TGN-NP (1:1)的脑靶向指数分别为2.83和3.78,脑靶向效果良好：TGN肽的修饰能有效提高纳米粒的脑内转运。其他组织的分布结果表明,NP和TGN-NP主要分布在脾,其次是肝和肺。CD68细胞染色的急性毒性实验结果显示,高剂量(18Qmg/kg)的TGN-NP不会引起Balb/c鼠大脑、小脑、心和肺的巨噬细胞增多,仅对肝和肾产生短暂的、一过性的轻微毒性,低剂量的TGN-NP不会引起脾的急性毒性反应。 第二部分第四章将TGN-NP包载具有神经保护作用的多肽药物NAP,研究其用于多肽蛋白药物脑内递送的可行性。采用复乳/溶媒蒸发法制备载多肽药物NAP的NP (NP/NAP);与TGN肽共价连接后制备载NAP的TGN-NP (TGN-NP/NAP);其粒径均在150nm左右,Zeta电位约为一19mV。采用双侧海马定位注射Aβ1-40聚集肽构建小鼠AD模型,通过Morris水迷宫实验评价NAP制剂对于小鼠学习能力及空间记忆障碍的治疗和改善作用。通过测定小鼠脑皮层与海马中乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱转移酶活力以及病理切片评价NAP制剂对中枢胆碱能神经元的保护作用。根据行为学研究、生化指标和病理切片结果,NAP溶液直接静脉注射或是皮下注射对于Aβ1-40所致小鼠老年性痴呆无改善作用,即使皮下注射剂量提高5倍(10μg/kg),对记忆能力及生化指标等的改善作用仍然不够理想。将NAP包载入NP后,能提高NAP在动物体内的稳定性,因此一定程度上改善小鼠的空间记忆障碍,但是NP/NAP在高剂量时(4μg/kg)仍未能使Aβ140所致小鼠老年性痴呆的记忆能力及生化指标恢复至正常水平。而将包载NAP的纳米粒表面修饰TGN后,能够显著提高NAP脑内递送的效率,在剂量比NAP溶液静脉注射及皮下注射低一倍的情况下(1μg/kg),已经能够产生明显的空间记忆改善作用,而将剂量提至2μg/kg和4μg/kg时,能显著降低小鼠大脑皮层与海马区的乙酰胆碱酯酶含量,提高乙酰胆碱转移酶含量,各项指标与正常对照小鼠无显著性差异。说明TGN-NP能够高效递送NAP等体内稳定性差、难以透过血脑屏障的蛋白多肽药物,具有良好的脑靶向性,有望显著提高对AD治疗效果。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R749.16
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2568029
