神经干细胞移植于血管性痴呆大鼠海马的研究

发布时间：2020-03-23 12:58

【摘要】： 目的： ①从新生大鼠的脊髓分离培养并鉴定神经干细胞，为神经干细胞的体外和体内研究建立一个技术平台；②探讨血管性痴呆大鼠模型的制作，为研究血管性痴呆的发病机理和防治建立基础；③探讨神经干细胞在血管性痴呆大鼠海马中的存活、迁移和分化，从而为神经干细胞的体内存活、迁移和分化机理研究和临床移植治疗提供实验依据。方法： ①利用无血清培养和单细胞克隆技术从新生大鼠脊髓分离具有单细胞克隆能力的细胞群并连续传代培养，获得大量克隆细胞，采用免疫荧光细胞化学技术检测巢蛋白(Nestin)和分化后特异性成熟神经细胞抗原表达；②利用永久性结扎大鼠双侧颈总动脉法建立痴呆模型，结扎后饲养30天，以Morris水迷宫定位航行试验和空问探索试验来检测模型的建立结果，并在光学显微镜下观察大鼠海马组织结构的变化；③利用脑立体定位技术将5—溴—2′—脱氧尿苷(BrdU)标记后的神经干细胞移植入血管性痴呆大鼠海马内，饲养8周后取脑，应用免疫荧光化学技术检测移植后细胞的生存、迁移和分化。结果： ①从新生大鼠脊髓分离的细胞群具有连续克隆能力，表达Nestin蛋白，分化后的细胞表达神经元、神经胶质细胞的特异性抗原；②成年大鼠在结扎双侧颈总动脉30天后，进行水迷宫试验，定位航行试验比较，实验组第1，4～7天平均逃避潜伏期较对照组长，两组有显著性差别；空间探索试验比较，60秒内，实验组与对照组大鼠在平台象限的滞留时间，实验组较对照组滞留时间短，大鼠出现明显的记忆能力下降，光学显微镜下显示海马CA1区锥体细胞数量减少，神经元核固缩；③用BrdU标记后的神经干细胞在移植入血管性痴呆大鼠海马8周后能检测到BrdU阳性细胞的存在并向四周迁移，并且用免疫荧光化学双标方法检测，可发现BrdU阳性细胞在海马锥体细胞层和颗粒细胞层为MAP_2阳性细胞，而海马其它部位则为GFAP或Gc阳性细胞。结论： ①从新生大鼠脊髓中分离培养出的细胞具有干细胞的自我更新、多分化潜能的生物学特征，是脊髓神经干细胞；②用结扎双侧颈总动脉方法能成功制作血管性痴呆大鼠模型:③将标记后脊髓神经干细胞移植入血管性痴呆大鼠的海马内，神经干细胞能生存，并且能够迁移至四周，在不同微环境下可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，显示神经干细胞具有强可塑性。
【图文】：

无血清培养液,体外培养,抗原

采用有限稀释法标记仅有]个细胞的培养孔并动态观察，结果显示单个在培养24h后分裂成2一4个细胞的集落，2一4d分裂成20一40个细胞的集7一lod均发展为上百个细胞的大克隆，细胞球形态同前，分散后能连续传分裂过程仍同上，呈悬浮球形生长。三、Not角抗原的表达和行rdU标记来自新生大鼠脊髓的细胞集落贴壁2h后用Nestin抗体行免疫荧光染果显示呈、estin抗原阳性(图2)。单细胞克隆后代与此相同。在传代30的克隆仍显示为Nestin抗原阳性。在有血清培养7d后行、estin免疫荧光未见任何Nestin抗原阳性细胞。Brd〔标记结果显示克隆的大部分细胞为阳性细胞，表明克隆主要山分裂增殖的细胞组成。单克隆化培养的细胞球用BrdU标记后，用抗BrdU抗体行免疫荧光染色3rdL抗原阳性(图3)。

多聚赖氨酸,克隆细胞,免疫荧光,玻片

图5在多聚赖氨酸包被玻片!几诱睁分化7d后克隆细胞早.以少，\l’}朴性日了!’!C免疫荧光)【K4()()讨沦!992年神经T细胞概念提出后，研究表明!’飞’“i，海与、纹状体、响室卜，撇svZ或室竹膜卜带侣EZ)是神经生发的队域，即使到J’成年，仍有神经儿发‘!一，血脊髓则价:成年没有神经瓜的生成，即使是脊髓损伤后，也只是生成镶痕组织来修艾纵然如此，脊髓，，!，也己发现有神经干细胞，并已为)”人研究者所一认1司，作为干细饱，脊髓神经干细胞也应具有以卜属性:;勿能生成神经组织或源自神经系统;②有fl我更新筱力，通过对称分裂能生成同己的子代红川泡:③有多分化潜能，通过不对称分裂能生成非己的子代细胞。作为神经一「细胞，根据1997年Mcka}’}”l在Science卜发表的文章认为.就是指具有分化为神经元细咆、狱形胶质细胞、少突胶质细胞的能力，能自我史新井足以提供人最脑组织细饱的细胞。祖细饱足相
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R749.16

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