单次剂量酒精撤退对海马神经元突触外δ-GABA_A受体的调节及机制研究

发布时间：2020-03-24 21:50

【摘要】：γ-氨基丁酸A型受体(GABAA受体)是一种配体门控氯离子通道,是由多个亚基装配而成的五聚体,它介导了脑内大多数抑制性神经传递的过程,并且它还是镇静催眠类药物包括酒精在内的主要靶点。酒精可以变构地增强GABAA受体的功能[1,2],而慢性酒精激活则可能导致GABAA受体出现可塑性变化,产生酒精耐受,酒精依赖以及酒精戒断综合征(AWS)。突触外含δ亚基的GABAA受体(δ-GABAA受体)对GABA有高亲和力和低效力,脱敏缓慢,对苯二氮卓类药物不敏感,以及在表达α4βδ受体的不同系统中对酒精均表现出高敏感性。研究发现突触外δ-GABAA受体内化可能是酒精引起GABAA受体可塑性改变的“导火索”,PKC介导的受体磷酸化可能参与酒精调节GABAA受体可塑性改变,但是具体机制和可能参与的PKC亚型尚待阐明。本实验在体外原代培养的大鼠海马神经元中,采用电生理、蛋白生化、分子生物学和荧光成像等技术,研究单次剂量酒精撤退引起突触外δ-GABAA受体快速内化的调节机制。我们发现,在单次剂量酒精(60 mM,30分钟)或okadaicacid(100nM,30分钟)预处理/撤退后30分钟,培养海马神经元突触外δ-GABAA受体介导的紧张性抑制电流(tonic current,Itonic)幅度明显减小,急性酒精对Itonic的增强作用也显著降低,即Itonic急性酒精耐受,提示蛋白磷酸化可能参与了单次剂量酒精撤退诱导的突触外δ-GABAA受体功能的降低。应用PKC抑制剂chelerythrine chloride(10 μM)处理可以明显挽救单次剂量酒精撤退引起的Itonic幅度下降和急性酒精耐受,但是PKA抑制剂H89(20 μM)处理则没有明显作用。此外,PKC激动剂佛波酯(100 nM)处理可引起与单次剂量酒精或okadaic acid处理后相似的Itonic幅度下降和急性酒精耐受,而PKA激动剂forskolin(10 μM)则没有作用,这提示我们PKC而非PKA介导的受体磷酸化参与了单次剂量酒精撤退诱导的突触外δ-GABAA受体的迅速内化。进一步实验发现抑制PKC可以阻断单次剂量酒精撤退引起的GABAA受体δ亚基膜表面表达的降低和重组GABAA受体δ亚基荧光强度的下降,进一步支持PKC可能参与酒精撤退对δ-GABAA受体的快速调控。Western blot结果显示单次剂量酒精撤退能够选择性地增加PKCδ而非PKCγ和PKCε的表达。选择性抑制PKCδ亚型不仅能够阻断单次剂量酒精撤退引起GABAA受体δ亚基膜表面表达的降低,而且也能挽救Itonic急性酒精耐受以及重组GABAA受体δ亚基荧光强度的下降。这些结果显示PKCδ亚型参与酒精撤退对突触外δ-GABAA受体的快速调控。以上结果说明,PKCδ介导的受体磷酸化在单次剂量酒精撤退对突触外GABAA受体δ亚基迅速内化的调控中起重要作用。PKCδ的活化很可能是酒精撤退引起GABAA受体可塑性改变的重要基础。这一发现可以为酒精耐受,酒精依赖以及AWS发病的神经生物学机制提供新的科学证据,以及临床治疗的新思路。
【图文】：

模拟酒,紧张性,突触,幅度

图３．１．１邋Ｏｋａｄａｉｃ邋ａｃｉｄ可以部分模拟酒精撤遐诱导的突触外ＧＡＢＡａ受体介导的紧张性电流（Ｉｔｒａｉｅ）逡逑幅度的减小和Ｉｔｔｍｉ。急性酒精耐受。图Ａ，对照（Ｃｔｒｌ）、酒精（Ｅ）和ｏｋａｄａｉｃ邋ａｃｉｄ邋（ＯＡ）预暴逡逑露撤逗３０分钟后记录的培养海马神经元Ｉｔａｎｉ。典型图。记录电流时的钳制电压为－７０ｍＶ，接着应逡逑用ｂｉｃｕｃｕｌｌｉｎｅ（ｂｉｃ，１０（ｉＭ），应用前后的ＩｈＱｌｄ用虚线表示以显示出ＩｔＱｎｉｅ幅度（基线为从左边开逡逑始的绿线；应用ｂｉｃｕｃｕｌｌｉｎｅ显示为开始于最右端附近的绿线）。图Ｂ，如图Ａ所示，各处理组药逡逑物撤退３０分钟时记录的神经元Ｉｔｔｍｉｅ幅度的变化。图Ｃ和Ｄ，如图Ｂ所示，各组神经元中ｍＩＰＳＣ的逡逑总电荷转移（ｍＩＰＳＣ面积，图Ｃ）和ｍＩＰＳＣ频率（图Ｄ）的变化。图Ｅ，如图Ａ所示的来自不逡逑同处理组的神经元，急性酒精（６０ｍＭ）处理之后应用ｂｉｃｕｃｕｌｌｉｎｅ记录的电生理典型图。急性逡逑酒精应用后的ＩＭｄ用粉红色虚线表示。图Ｆ，图Ｅ记录的急性酒精处理对Ｉｔｃｍｋ幅度的影响。每组ｎ逡逑为１２－１５个细胞。与对照组神经元相比，户＜邋０．０１邋（单因素方差分析）；与对照组神经元相比，逡逑＊Ｐ＜邋０．００１邋（双因素方差分析）；与急性酒精处理前相比，佑＜0．0１邋（双因素方差分析）。数逡逑据表示为Ｍｅａｎ士邋ＳＥＭ。逡逑

酒精,幅度

１１Ｍ）来确定在没有酒精作用情况下，机体内ＰＫＣ激活是否具有相似的作用。结果逡逑显示，，ＰＤＢｕ预暴露（Ｐ组）可以导致Ｉｔｏｎｉｃ幅度的减小以及Ｉｔ＿急性酒精耐受（图逡逑３．２．１Ｂ和表１），这与在ＯＡ处理组中观察到的结果相似（图３．１．１Ｆ），但ＰＫＡ激逡逑动剂ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ邋（Ｆ，邋１０邋ｎＭ）单独处理则没有相似作用（图３．２．１邋Ｂ和表１），表明逡逑ＰＫＣ激活而非ＰＫＡ激活参与了单次剂量酒精撤退对突触外Ｓ－ＧＡＢＡａ受体功能的逡逑快速调节。逡逑八逦Ａｃｕｔｅ邋ｅｔｈａｎｏｌ邋６０邋ｍＭ邋逦ｂｉｃ逦Ｂ逡逑ｎｔＨ逦逦邋 NB邋■…一逦－逦４０］令邋Ｃｔｒｌ逦ｈ＋Ｅ邋十逡逑Ｃｔｆ１逦逦Ｚ９Ｊ１Ｌ逦？Ｅ＂Ｔ＿Ｆｉ邋＋逡逑ｒＴＰｐｍ逦丨喊逦３。逡逑Ｅ邋ｉＴｒｐ＾Ｔｒｒｒｒｆｒｒｒｆ：：＾＾＂＾：邋［１：邋５２。逡逑————邋－逦１邋ｏ逡逑＾ＴＴＴ＾邋＾ｒｆ＾ｆｗ５逦°邋0逦＾逡逑Ｉ逦［Ａｃｕｔｅ邋ｅｔｈａｎｏｌ］邋（ｍＭ）逡逑Ｈ＋Ｅ逦逦邋：二：逡逑图３．２．１抑制ＰＫＣ作用可阻断单次剂量酒精撤退诱导的Ｉｔｏｎｉｅ幅度的减小和急性酒精耐受。图Ａ，逡逑对照（Ｃｔｒｌ），酒精（Ｅ），邋ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｉｎｅｃｈｌｏｒｉｄｅ邋加酒精（Ｃ＋Ｅ）和邋Ｈ－８９邋加酒精（Ｈ＋Ｅ）撤退邋３０逡逑分钟后记录的培养海马神经元Ｉｔｃｍｉｅ典型图。图Ｂ，对照（Ｃｔｒｌ），酒精（Ｅ），邋ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｉｎｅｃｈｌｏｒｉｄｅ逡逑加酒精（Ｃ＋Ｅ）
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R749.62

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