阿尔茨海默病中钙依赖性蛋白激酶A调节亚基Ⅱα磷酸化及其对PKA-CREB通路的影响

发布时间：2020-03-27 16:44

【摘要】：第一部分体外钙离子孵育对C57BL/6小鼠脑神经元及PC12细胞内PKA-RⅡα分子量表达的影响目的探讨cAMP依赖性蛋白激酶(cAMP-dependent protein kinase, PKA)调节亚基Ⅱα(RⅡα)在C57BL/6小鼠脑神经元体外钙离子孵育及加入不同干扰因素条件下的表达变化。方法取8只C57BL/6小鼠前脑组织匀浆裂解随机分为8组,分别应用以下条件予以处理：匀浆后不孵育作为对照1,不作处理仅30℃孵育10min作为对照2,应用2.5mmol/LCaCl2孵育,CaCl2孵育前加入钙离子螯合剂EDTA,CaCl2孵育后加入EDTA再次孵育,CaCl2孵育后加入碱性磷酸酶再次孵育,CaCl2孵育前应用外源性PKA绑定蛋白Ht31孵育,CaCl2孵育前应用无活性外源性PKA绑定蛋白Ht31P孵育；同时将大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC 12 cell)随机分为8组,裂解后与前述做相同处理。应用Western blot法检测脑组织及细胞内RⅡα的表达情况结果小鼠前脑组织及PC12细胞裂解产物中,对照组1和2内RⅡα表观分子量为51 kDa；与CaCl2孵育后,RⅡα表观分子量为53kDa；若在CaCl2孵育前加入EDTA,则RⅡα分子量为51kDa;CaCl2呼育后加入EDTA则其分子量为53kDa；CaCl2孵育后加入碱性磷酸酶再次孵育,RⅡα分子量为51kDa；CaCl2孵育前加入Ht31或Ht31P,RⅡα分子量皆为53kDa。结论RⅡα的分子量升高变化与Ca2+有关,且能被磷酸酶逆转,与RⅡα的AKAP结合活性无关。第二部分PC12细胞内钙离子超载对PKA调节亚基RⅡα表达的影响目的探讨细胞内钙离子超载状态下PKA各亚基的表达变化方法分别应用Aβ1-42寡聚体及KC1造成PC12细胞内钙超载。采用5μmol/L及10μmol/L的Aβ1-4237℃条件下分别孵育PC12细胞30min,1h,2h,4h,12h,采用50mmol/L及100mmol/L的KC137℃条件下分别孵育PC12细胞5min,10min,20min, 30min,60min。MTT法检测细胞活性,Western blot法检测细胞内RⅡα亚基的表达。结果Aβ1-42寡聚体及KCl孵育PC12细胞后,皆对PC12细胞活性造成不同程度影响,随着孵育时间的延长细胞活性逐渐下降。Western blot检测孵育后PKA调节亚基RⅡα先出现蛋白分子量的升高现象,与第一部分结果相似,同时,随着孵育时间的延长,RⅡ分子量回到正常水平。结论Ap1-42寡聚体及KCl对PC12细胞有明显毒性作用,并可致RⅡα蛋白分子量升高,其后则恢复到正常水平。第三部分不同激酶抑制剂对RⅡα分子量变化的影响目的研究不同激酶抑制剂对RⅡα分子量变化的影响,找出使得RⅡα分子量变化的具体激酶。方法以5μmol/L的Aβ1-42寡聚体37℃条件下孵育PC12细胞2h及100mmol/L的KC137℃条件下孵育PC12细胞20min造成RⅡα分子量变化模型,以未处理的PC12细胞为空白对照,分别同时应用PKA抑制剂H89、PKC抑制剂Staurosporine、CaM抑制剂W-7,应用Western blot检测各组RⅡα分子量表达变化。结果5μmol/L的Aβ1-42寡聚体处理PC12细胞2h及100mmol/L的KCl处理PC12细胞20min后,RⅡα分子量由51kDa上升为53kDa,同时分别应用H89、Staurosporine,W-7后,仅W-7能逆转这种分子量表达的变化。结论RⅡα分子量的变化为CaMK所致的磷酸化,这种磷酸化与PKA或PKC无明显关系。第四部分Aβ1-42对PC12细胞内PKA活性的影响目的研究Aβ1-42孵育对PC12细胞内PKA活性的影响方法研究Aβ142寡聚体不同孵育时间下对PKA活性的影响,PC12细胞随机分组如下：5μmol/L的Aβ1-42于37℃条件下分别孵育PC12细胞Omin、30min、1h、2h、4h、12h、;研究不同干预条件下钙超载对PKA活性的影响,PC12细胞随机分组如下：对照组：不作任何干预,实验组：5μmol/L的Aβ1-42寡聚体于37℃C孵育2h,10μmol/L的W-7处理1h,10μmol/L的W-7预处理1h+5μmol/L的Aβ1-42寡聚体孵育2h, 50μmol/L的Ht31+5μmol/L的Aβ1-42寡聚体孵育2h,50μmol/L的Ht31P+5μmol/L的Aβ1-42寡聚体孵育2h。孵育后采用Western blot检测细胞内PKA磷酸化底物表达水平,以证实PKA活性变化。结果Aβ1-42寡聚体处理PC12细胞后细胞内磷酸化PKA底物表达先升高后降低,单用W-7对磷酸化PKA底物表达无明显影响,Aβ1-42寡聚体干预前W-7的加入抑制了磷酸化PKA底物表达的升高,Ht31及Ht31P的加入均对磷酸化PKA底物表达无明显影响。结论Aβ1-42寡聚体所致细胞内钙超载显著影响了PKA的活性,W-7抑制PKA活性升高可能与其抑制了RⅡα磷酸化有关,PKA的活性变化与其AKAP结合位点无关。第五部分钙离子超载对PC12细胞内CREB活性的影响目的研究PC12细胞内钙离子超载状态下,CREB活性的变化。方法将PC12细胞随机分为对照组与实验组,对照组不作任何干预,Aβ1-42实验组分组如下：W-7组、Aβ1-42组、W-7+Ap1-42组,Aβ1-42+H89组、Aβ1-42+staurosporine组；KCl实验组分组如下：W-7组、KCl组、W-7+KC1组,KCl+H89组、KCl+staurosporine组。孵育后采用Western blot检测细胞内磷酸化CREB (pCREB)水平,以证实CREB活性变化。结果Aβ1-42及KCl处理PC12细胞后细胞内pCREB表达增加,单用W-7对pCREB表达无明显影响,Aβ1-42及KC1干预前W-7的加入抑制了pCREB表达的升高,H89的加入显著减少了pCREB的表达,staurosporine的加入对pCREB表达变化无明显影响。结论Aβ1-42及KC1所致细胞内钙超载显著影响了CREB的激活,W-7可抑制CREB的激活,可能与其抑制了RⅡα磷酸化有关,CREB的激活主要与PKA的活性相关,与PKC无关。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R749.16

【参考文献】