空间学习通过上调海马miR-191改善慢性应激诱导的大鼠抑郁行为

发布时间：2020-04-02 17:36

【摘要】：背景抑郁症是由社会、生理、心理等多种因素相互作用而导致的疾病,其中应激是抑郁症发病的重要诱因之一。世界卫生组织最新统计数据显示,目前全球约有3亿抑郁症患者,5000万痴呆患者[1]。由于缺乏有效的治疗措施,预计至2030年抑郁症将上升至世界疾病负担首位。因此,深入认识抑郁的发生、探索干预抑郁的有效措施,具有极其重要的医学及社会意义。磁共振检测显示,抑郁患者的一些脑区,如额叶、海马、颞叶、丘脑、纹状体和杏仁核均存在体积减小。抑郁患者尸检结果也显示海马、杏仁核、前额叶皮质和纹状体等脑区存在明显的萎缩。海马是大脑内侧颞叶的边缘系统结构,承担空间学习记忆和导航的重要功能,同时也参与情绪调节。海马在抑郁发病过程中的作用受到越来越多的关注。持续的空间定位训练会增加海马的体积、海马神经发生、突触发生以及树突棘数量。给予抑郁患者认知功能相关的学习任务后,患者的临床症状可得到改善。因此,通过对改善海马功能能否改善抑郁行为的研究,具有十分重要的意义,寻找出其中的关键性分子对阐明抑郁发病机制和制定治疗策略的也尤为重要。小分子RNA(MicroRNAs,miRNA)是长度约22-24个核苷酸的非编码RNA的一个亚类,miRNA主要通过影响靶信使RNA(mRNA)表达而发挥其功能,每个miRNA可能潜在地靶向数百种不同的mRNA。研究表明,miR-191参与调节神经元发育和神经元活性、参与学习或记忆过程、与神经元凋亡过程相关以及参与激活蛋白激酶A的活性等,但miR-191在抑郁发生发展过程中的作用尚不十分清楚。目的探究空间学习能否改善抑郁大鼠的抑郁行为;分析空间学习改善大鼠抑郁的海马蛋白组学基础;阐明miR-191在空间学习改善大鼠抑郁中的作用及机制。方法采用21天慢性不可预知性应激(Chronic unpredicted stress,CUS)复制大鼠抑郁模型。采用旷场实验(Open field test,OFT)、强迫游泳实验(Forced swimming test,FST),糖水偏好实验(Sucrose preference test,SPT)综合评价大鼠的行为状态。抑郁评价标准:SPT中糖水消耗百分比减少30%以上且在FST中的不动时间增加超过50%的大鼠为抑郁大鼠。1)120只2月龄雄性SD大鼠(200g±20g)随机分为对照组(n=25,CON)和CUS组(n=95)。造模21天后,CUS组38只大鼠表现出明显抑郁行为。随机选取其中15只抑郁大鼠,给予7天的Morris水迷宫训练,为抑郁后学习组(D-L);同时选取15只抑郁大鼠进行游泳训练(每天的游泳时间与D-L组的平均延迟时间相同),为抑郁后游泳组(D-S)。7天后进行行为学检测及其它分析。2)miR-191研究:84只SD大鼠随机分为CUS组(n=60)及未应激对照组(n=24),CUS组大鼠应激一周后,采用SPT筛选出具有抑郁倾向的大鼠26只(连续2天SPT中糖水消耗比例65%定义为抑郁倾向)。将抑郁倾向大鼠随机分为两组:一组大鼠进行双侧海马CA3区注射miR191激动剂Agomir-miR191(n=15,CUS+Agomir-miR191),一组大鼠进行双侧海马CA3区注射PBS对照(n=11,CUS+PBS);海马注射后继续应激2周。同时将未应激大鼠随机分为两组:一组大鼠进行双侧海马CA3区注射miR191拮抗剂Antagomir-miR191(n=12,Antagomir-miR191),一组大鼠进行双侧海马CA3区注射PBS对照(n=12,PBS);同步喂养2周。处理结束后将上述4组大鼠进行行为学检测及其它分析。相关检测:采用基于同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)的蛋白质组学技术,检测并筛选出各组大鼠海马组织差异表达蛋白。还采用了免疫印迹、免疫荧光、免疫组织化学和定量PCR等技术。结果1.空间学习改善CUS诱导的大鼠抑郁行为95只CUS大鼠中,38只于21天后表现出明显抑郁行为。具体表现为:在OFT中的穿越格子数、双上肢上抬次数和运动距离明显减少,在FST中的静止时间从65 s延长为114 s,SPT显示其糖水消耗百分比从84%降低至52%。Morris水迷宫学习7天后,D-L大鼠在OFT中的穿越格子数、双上肢上抬次数和运动距离显著增加,在FST中的静止时间减少至43 s,在SPT中的糖水消耗百分比为72%;而D-S大鼠在OFT中的穿越格子数、双上肢上抬次数和运动距离依旧低于CON大鼠,在FST中的静止时间为92 s,在SPT中的糖水消耗百分比为45%。综上说明,空间学习可显著改善CUS诱导的大鼠抑郁行为。2.空间学习提高突触相关蛋白的水平、提高少突胶质细胞相关蛋白的水平及调节蛋白激酶和蛋白磷酸酶的异常蛋白组学分析:分析CON、D-S和D-L三组大鼠(n=3)的海马差异蛋白。共鉴定出4756个蛋白,定量了3482个蛋白。其中,在D-S/CON中有11种上调蛋白和11种下调蛋白;在D-L/CON中有42种上调蛋白和11种下调蛋白;在D-L/D-S中有26种上调蛋白和8种下调蛋白。生物信息学分析的结果显示:G蛋白偶联谷氨酸受体信号通路、谷氨酸释放、谷氨酸转运、蛋白激酶C激活G蛋白偶联受体信号通路、蛋白激酶B信号通路和微管聚合或解聚等通路发生了改变。同时,多个少突胶质细胞相关蛋白的水平也发生了变化。免疫印迹结果显示,D-L大鼠的SNAP25和PSD95水平显著高于D-S大鼠32%和53%,达到CON大鼠的水平;D-L大鼠相较D-S大鼠的NR1、GluR1和GluR2水平增加了33%、55%和57%;D-L大鼠NR2B的水平比CON大鼠增加了45%,比D-S大鼠增加了45%。D-L大鼠PLP1水平比CON大鼠增加了48%;与D-S大鼠相比,D-L大鼠MAG增加了22%,PLP1增加了85%。D-L大鼠PKAα的水平显著降低,比CON大鼠降低了44%,比D-S大鼠降低了41%;D-S大鼠和D-L大鼠海马中的GSK-3β水平分别比CON大鼠增加了169%和119%;D-S大鼠PP2Ac水平比CON大鼠增加了42%;D-L大鼠PP2A-Y307与CON大鼠和D-S大鼠相比,分别下降了34%和33%;D-L大鼠的PPP1A水平比CON大鼠和D-S大鼠分别下降48%和42%。3.抑郁大鼠的海马神经元数量减少、凋亡水平增加尼氏染色结果显示,抑郁大鼠海马CA1、CA3和DG区神经元数量相较对照组大鼠分别下降20%、29%和22%。免疫印迹结果显示,与对照组相比,抑郁大鼠海马死亡相关蛋白激酶1(Death-associated protein kinase 1,DAPK1)增加48%,Caspase 3增加32%,Cleaved caspase 3增加50%,Beclin1增加33%,LC3II/I比值增加53%,提示凋亡和自噬水平上升。在体外模拟神经元CUS暴露:10~-44 M糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)处理原代培养神经元24 h后,与对照神经元相比,DAPK1增加62%,Caspase 3增加83%,Cleaved caspase 3增加53%,Beclin1增加36%,LC3 II/I比值增加35%。4.空间学习降低抑郁大鼠海马DAPK1水平、增加miR-191水平与CON大鼠相比,D-S大鼠海马DAPK1增加41%,Cleaved caspase 3增加52%,Beclin1增加54%,LC3 II/I比值增加59%。D-L大鼠比D-S大鼠的DAPK1减少26%,Cleaved caspase 3减少36%,Beclin1减少41%,但LC3 II/I比值仍高于对照组40%。定量PCR结果显示,D-S大鼠miR-191水平显著低于CON大鼠45%,D-L大鼠海马miR-191水平较D-S大鼠上升了131%,与CON大鼠无差异。5.上调miR-191水平改善慢性应激诱导的大鼠抑郁行为为研究miR-191与DAPK1变化的关系,在培养的N2a细胞中下调miR-191水平后,DAPK1增加52%,Caspase 3增加44%,Cleaved caspase 3增加31%,Beclin1增加45%,LC3 II/I比值增加78%。说明miR-191下调可诱导DAPK1上调。同时,双荧光素酶结合实验验证了miR-191与DAPK1的直接靶向关系。Antagomir-miR191大鼠在OFT中的穿越格子数、双上肢上抬次数和运动距离较PBS大鼠分别下降44%、55%和46%;在FST中的静止时间为113 s;在SPT中的糖水消耗百分减少了29%。CUS+Agomir-miR191大鼠在OFT中的穿越格子数和运动距离较CUS+PBS组分别增加94%和96%;在FST的静止时间从125 s下降至70 s;在SPT中的糖水消耗百分比增加了55%。与PBS大鼠相比,Antagomir-miR191大鼠海马CA1、CA3和DG区神经元数量分别下降21%、25%和34%;DAPK1增加40%,Caspase 3增加54%,Cleaved caspase 3增加68%,Beclin1增加47%,LC3 II/I比值增加27%。与CUS+PBS大鼠相比,CUS+Agomir-miR191大鼠海马CA1、CA3和DG区神经元数量分别增加35%、35%和38%;DAPK1降低24%,Caspase 3降低32%,Cleaved caspase 3降低31%,Beclin1降低26%,LC3 II/I比值降低17%。结论空间学习能通过上调抑郁大鼠海马miR-191水平,靶向下调DAPK1水平,减少海马神经元的丢失,从而改善CUS诱导的大鼠抑郁行为。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R749.4

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