5羟色胺2C受体激动剂调控ouabain诱发躁狂症的机制研究

发布时间：2020-04-05 07:17

【摘要】：背景:躁狂症是一种典型的精神疾病,是双向情感障碍的发作形式之一,临床表现为心境高涨、思维奔逸、精神运动性兴奋、自我评价过高等。躁狂症发作时,患者情绪失控,高危行为增加,易诱发躯体疾病,严重破坏社会功能。躁狂症作为一种影响广泛的情绪疾病,其病理生理学机制尚不清楚。典型抗精神病药即多巴胺第二受体阻断剂,能有效控制精神疾病的症状,但副作用较多,例如焦虑、抑郁、恶性症状群等。非典型抗精神病药通过5-羟色胺受体、谷氨酸受体发挥作用,例如5-羟色胺2C受体(5-HT_(2C) receptor,5-hydroxytryptamine 2C receptor)激动剂MK212,该工具药对精神疾病的阴性症状和阳性症状均有良好的作用,副作用相对较小。一般来说,心境稳定剂常用于急性躁狂症的治疗,例如锂盐、丙戊酸盐等。目前,非典型抗精神病药也广泛用于躁狂症的治疗。哇巴因(ouabain)是一种钠钾ATP酶特异性抑制剂,向大鼠的侧脑室注射哇巴因,可诱发大鼠极度活跃行为,作为稳定的躁狂症动物模型,用于考察5-HT_(2C)受体激动剂MK212的抗躁狂作用。精神疾病与信号转导通路密切相关,糖原合成酶激酶3β(GSK3β,Glycogen synthetase kinase 3)作为中介物,涉及多条信号转导通路,也受蛋白复合物的调控,如PI_3/AKT通路、WNT通路等,躁狂症患者多个脑区GSK3β功能异常,其活性变化可能与双向情感障碍发病机制有关。谷氨酸系统异常是躁狂症的发病机制之一,研究发现,MK212可以不通过内源性多巴胺,直接发挥抗精神病作用,并降低伏隔核脑区的谷氨酸浓度,推测谷氨酸系统可能是MK212发挥抗精神病作用的潜在机制。目前,暂无5-HT_(2C)受体激动剂MK212用于躁狂症治疗的研究,也无法证明5-羟色胺2C受体就是非典型抗精神病药发挥抗躁狂作用的机制,以及是否通过调控GSK3β信号通路或谷氨酸系统发挥作用。研究假设:推测躁狂症模型大鼠腹腔注射MK212,其活动性明显抑制,即MK212能抑制急性躁狂症的典型症状,5-HT_(2C)受体是非典型抗精神病药发挥抗躁狂作用的机制,其作用具有高度特异性。另外,MK212通过调控GSK3β相关信号通路发挥抗躁狂作用,在目标脑区,如内侧前额叶、纹状体和海马,如果对照组和各实验组的GSK3β蛋白总量和磷酸化水平发生相应变化,说明GSK3β相关信号通路是躁狂症的细胞生物学基础。最后,如果MK212能抑制大鼠脑内谷氨酸能神经元的兴奋性,说明MK212可能通过调控谷氨酸系统发挥抗躁狂作用。实验目的:阐明5-HT_(2C)受体激动剂MK212的抗躁狂作用,以及MK212是否通过GSK3β相关信号通路或谷氨酸系统发挥效应。实验方法:实验一使用自发活动范式,向大鼠侧脑室注射哇巴因(1 mmol/L,5μl),引发急性躁狂症状,表现为活动性显著升高。大鼠腹腔注射5-HT_(2C)受体激动剂(MK212,0.1/0.5 mg/kg),观察能否抑制高自发活动,再腹腔注射5-HT_(2C)受体拮抗剂(SB242084,1.0 mg/kg),如果5-HT_(2C)受体在躁狂症发病机制中具有特异性,SB242084应该能逆转MK212对躁狂症症状的抑制作用。实验二采用蛋白质印迹法,实验一结束后,分离对照组与实验组动物的脑组织,包括内侧前额叶、纹状体和海马,提取蛋白质复合物,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,将目标蛋白与特异性抗体结合,考察GSK3β蛋白总量和磷酸化水平的变化,研究MK212是否通过GSK3β相关信号通路发挥抗躁狂作用。如果MK212通过GSK3β相关信号通路发挥抗躁狂作用,那么与对照组相比,实验组动物各个脑区的GSK3β蛋白总量以及磷酸化水平应该发生明显变化。反之,如果未发生明显变化,则MK212可能通过其他下游信号通路产生效应,GSK3β信号通路可能不是抗躁狂症药物发挥作用的细胞生物学基础。实验三通过膜片钳技术,在全细胞记录模式下,记录大鼠内侧前额叶第Ⅴ/Ⅵ层锥体神经元自发兴奋性突触后电流(sEPSCs,spontaneous excited postsynaptic currents),循环灌流MK212(10/30/100μM),观察自发兴奋性突触后电流频率和幅度的变化。如果自发兴奋性突触后电流的频率发生变化,说明MK212作用于突触前成分,可能调控谷氨酸释放,如果幅度发生变化,说明MK212介导突触后谷氨酸受体的功能。若二者均无变化,说明MK212未通过调控谷氨酸系统发挥作用。结果:实验一结果表明,腹腔注射0.5 mg/kg的MK212,15分钟之后,显著降低躁狂组动物的移动轨迹(p=0.000,n=8)和移动速度(p=0.000,n=8)。SB242084(1.0 mg/kg,i.p)能逆转MK212对移动轨迹(p=0.785,n=8)和移动速度(p=0.579,n=8)的抑制,使动物恢复极度活跃状态。该结果说明,MK212能抑制哇巴因诱发的极度活跃行为,SB242084能逆转MK212对极度活跃行为的抑制,即5-HT_(2C)受体激动剂MK212具有抗躁狂效应,5-HT_(2C)受体在躁狂症病理生理学机制中具有特异性。实验二结果表明,对照组与各实验组的内侧前额叶(p=0.184,n=8)、纹状体(p=0.249,n=8)和海马(p=0.474,n=8)的GSK3β蛋白总量无显著差异,该结果说明,各实验处理不影响GSK3β蛋白总量的表达水平。对照组与各实验组的内侧前额叶(p=0.063,n=8)、纹状体(p=0.415,n=8)和海马(p=0.227,n=8)的GSK3βser 9位点磷酸化水平无显著差异,该结果表明,GSK3βser 9位点可能不是MK212发挥抗躁狂作用的生理机制。实验三结果表明,与对照组相比,灌注MK212(100μM)显著降低内侧前额叶第Ⅴ/Ⅵ层锥体神经元自发兴奋性突触后电流的频率(p=0.046,n=8),其他剂量MK212(10/30μM)对发放频率无显著作用。另外,MK212(10/30/100μM)对自发兴奋性突触后电流的幅度无明显影响。该结果表明,MK212(100μM)作用于突触前成分,能抑制突触前谷氨酸的释放,此外,MK212(100μM)不影响突触后谷氨酸受体的活性。MK212对谷氨酸系统的调控,可能是其发挥抗躁狂作用的潜在机制。结论:非典型抗精神病药5-HT_(2C)受体激动剂MK212可独立发挥抗躁狂作用,不依赖其他心境稳定剂,能有效抑制躁狂症大鼠模型的高自发活动,体现了非典型抗精神病药治疗躁狂症的潜力,以及5-HT_(2C)受体在躁狂症治疗中的高度特异性。MK212未通过GSK3β相关信号通路实现对躁狂症的调控,可能存在其他相关的信号转导通路。MK212调控谷氨酸系统,抑制内侧前额叶锥体神经元突触前谷氨酸的释放,可能与躁狂症的发病机制有关。
【图文】：

侧脑室,哇巴因,生理盐水,微量注射器

大鼠随机分成 5 组（n = 8），分别为生理盐水组、哇巴因组、哇巴因 + MK212（0.1 mg/kg）+ 生理盐水、哇巴因 + MK212（0.5 mg/kg） + 生理盐水、哇巴因 + MK212（0.5mg/kg）+ SB242084（1.0 mg/kg）。0.9%生理盐水、MK212（0.1 mg/kg、0.5 mg/kg）和 SB242084（1.0 mg/kg）采用腹腔注射。人工脑脊液（ACSF）和哇巴因（ouabain）采用侧脑室微量注射。本实验选用 GENIETOUCH注射泵和 HAMILTON 微量注射器（10 μl，51 mm），超纯水清洗微量注射器，，抽入少量超纯水，固定于注射泵。将注射内管和塑料导管连接，用超纯水反复冲洗,保证塑料导管内充满超纯水。将塑料导管另一端迅速连接至微量注射器，避免气泡。设置注射泵的参数，选择微量注射器的型号，注射体积为 5 μl，注射速度保持在 1.5 μl/min 左右，避免侧脑室变形。每次注射结束后，停留 1-2 分钟，再将注射内管拔出，确保药物扩散。根据动物的体重计算每个药物的注射体积。生理盐水组于造模前 30 分钟、15分别腹腔注射两次 0.9%生理盐水，造模前 5 分钟，向右侧脑室注射人工脑脊液，停留 1-2 分钟，即可进行自发活动测试。哇巴因组与生理盐水组类似，只须向右

对极,哇巴因,生理盐水,差异显著

根据图 3-3（A）所示，生理盐水组与各实验组动物的移动距离差异显著[F(3, 3= 19.318, p = 0.000]。首先，哇巴因造模组与生理盐水组的移动轨迹差异显著（p 0.000），表明造模成功。其次，哇巴因 + MK212（0.1 mg/kg）+ 生理盐水组与哇15
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R749

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