糖原合酶激酶-3β乙酰化以及孕期环境丰富在阿尔兹海默病样神经损伤或保护中的作用及机制研究

发布时间：2020-04-12 15:34

【摘要】：背景:阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一种神经退行性疾病,该疾病最相关的组织病理学标志是由β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)组成的细胞外老年斑和主要由过度磷酸化的Tau蛋白形成的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)。糖原合酶激酶-3(Glycogen synthase kinase-3,GSK-3)在神经系统中广泛表达。糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)是GSK-3的一个重要亚型。糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)过度激活可导致Tau蛋白过度磷酸化、突触损伤和学习记忆障碍,在AD的发生发展中起重要作用。然而,GSK-3β在AD进程中持续激活的机制尚不清楚。本实验室前期研究发现在AD转基因小鼠中GSK-3b乙酰化水平升高,但GSK-3b乙酰化在AD发生发展中的作用及其升高的机制尚不清楚。目的:探索GSK-3b乙酰化在AD的发生发展中的作用及其潜在的分子机制方法:在过表达Tau蛋白的HEK293细胞模型中,通过质谱分析确定GSK-3b乙酰化显著升高的位点,并制备特异性抗体,用该抗体检测AD模型动物中GSK-3b该位点的乙酰化水平;在多种细胞系中过表达GSK-3b赖氨酸15位点模拟乙酰化点突变质粒,运用GSK-3b酶活性检测法,免疫蛋白印记,免疫沉淀,免疫组织化学技术检测GSK-3b赖氨酸15位点模拟乙酰化后对其蛋白激酶活性,蛋白表达水平,泛素化水平及降解曲线的影响。在C57小鼠海马CA1区注射GSK-3b赖氨酸15位点模拟乙酰化点突变腺相关病毒,运用小鼠行为学,免疫蛋白印记,免疫沉淀,免疫组织化学,免疫荧光等技术对小鼠的学习记忆及情绪,Tau蛋白的磷酸化,神经炎症相关因素(小胶质细胞和星形胶质细胞激活情况)以及突触相关蛋白的表达水平进行检测。在多种细胞系中过表达Tau全长及乙酰转移酶活性区域缺失的Tau-k18(-)质粒,运用免疫蛋白印记,免疫沉淀,免疫组织化学技术检测Tau转移酶活性对GSK-3b蛋白水平,乙酰化水平,泛素化水平及降解曲线的影响。运用纯化蛋白进行体外乙酰化的实验来验证Tau对GSK-3b的直接乙酰化作用。结果:1、在多种AD样细胞和小鼠模型中均可见GSK-3β赖氨酸15位点乙酰化水平升高通过质谱分析确定在HEK293转Tau模型中GSK-3β赖氨酸15位点存在乙酰化修饰,根据该结果制备特异性的识别GSK-3β赖氨酸15位点乙酰化的抗体,并用该抗体检测多种AD模型动物(3xTg,APP/PS1,Tau+)发现GSK-3β乙酰化水平升高。2、GSK-3β赖氨酸15位点乙酰化增强其酶活性并抑制其泛素化和降解构建GSK-3βK15Q质粒模拟GSK-3β赖氨酸15位点乙酰化,发现GSK-3βK15Q显著增强其蛋白激酶活性,并显著降低了GSK-3β蛋白的降解,且GSK-3β自身泛素化水平显著降低。3、GSK-3β赖氨酸15位点乙酰化导致小鼠认知能力损伤以及情绪障碍在C57小鼠海马CA1区注射GSK-3β赖氨酸15位点模拟乙酰化点突变GSK-3βK15Q腺相关病毒,发现GSK-3βK15Q可以导致小鼠的认知功能损伤和情绪障碍。4、GSK-3β赖氨酸15位点乙酰化促进Tau的过度磷酸化及胶质细胞的激活在C57小鼠海马CA1区注射GSK-3βK15Q腺相关病毒,发现GSK-3βK15Q促进了小鼠海马区Tau的过度磷酸化,并显著激活了小胶质细胞和星形胶质细胞。5、GSK-3β赖氨酸15位点乙酰化导致小鼠突触可塑性损伤在C57小鼠海马CA1区注射GSK-3βK15Q腺相关病毒,发现GSK-3βK15Q导致小鼠突触相关蛋白的表达下降。6、Tau促进GSK-3β赖氨酸15位点乙酰化,增加GSK-3β蛋白水平和酶活性AD转基因小鼠和细胞结果表明Tau增加了GSK-3β赖氨酸15位点乙酰化,并导致了GSK-3β的蛋白水平和酶活性增加。7、Tau的乙酰转移酶区域介导了其对GSK-3β的蛋白水平,乙酰化水平的升高及泛素化水平降低。构建消除乙酰转移酶活性的Tau-K18(-)质粒,结果显示:Tau的乙酰转移酶区域介导了其对GSK-3β的蛋白水平,乙酰化水平的升高及泛素化水平降低。8、Tau蛋白可以直接乙酰化GSK-3β构建Tau,Tau-K18(-)及GSK-3β的纯化蛋白,体外乙酰化的实验证明Tau可以直接乙酰化GSK-3β,Tau-K18(-)废除其对GSK-3β的乙酰化。结论:GSK-3β乙酰化可以增加其酶活性并促进AD样病变,Tau蛋白可以乙酰化GSK-3b,GSK-3b的乙酰化会竞争性抑制其泛素化从而抑制其蛋白降解且增强其酶活性。背景:在痴呆症发作前建立大脑储备可能是预防阿尔茨海默病(AD)的一个有前途的策略,而如何启动早期认知刺激尚不清楚。考虑到不成熟的大脑对环境刺激更敏感,而且随着年龄的增长,大脑的活力会下降,我们推断早在胎儿时期就开始对AD进行认知刺激是有效的。目的:探讨孕期丰富环境是否可以预防子代的阿尔兹海默症及其潜在的机制方法:在受孕后,将母代的AD转基因小鼠(3x Tg AD)进行孕期丰富环境(gestational environment enrichment,GEE)直到生产。子代小鼠放置于标准环境中并生长至7月龄大,通过莫里斯水迷宫(Morris water maze)和情境恐惧条件反射测试(context fear-conditioning test)来评估7月龄子代小鼠的认知能力。采用蛋白免疫印迹,免疫组织化学,实时荧光定量PCR,染色质免疫共沉淀(CHIP),电生理记录,高尔基染色,活性实验以及夹心酶联免疫分析等方法来深入了解GEE对胚胎及7-10月龄成年后代有益作用的机制。结果:我们发现GEE显著地保留了7-10月龄的AD模型鼠的突触可塑性和记忆容量,同时伴随着AD的标志性病理的改善。GEE的有益作用伴随着总的组蛋白的高乙酰化,包括BDNF启动子结合区域的组蛋白高乙酰化,在胚胎和子代海马中都具有强健的BDNF m RNA和蛋白表达。GEE使胰岛素样生长因子1(IGF1)表达增加并激活其受体(IGF1R)从而磷酸化Ca2+/钙调素依赖性激酶IV(Ca MKIV)的酪氨酸位点,并触发其核易位,最终导致组蛋白乙酰转移酶(HAT)和BDNF转录的上调。IGF1的上调模拟了GEE的作用,而妊娠期抑制IGF1R或HAT则消除了GEE诱导的camkiv依赖性的组蛋白高乙酰化和BDNF的上调。结论:通过孕期丰富环境可以激活IGF1R/Ca MKIV/HAT/BDNF信号可能是延缓AD进展的一种有前途的策略。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R749.16

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