H102抑制β-淀粉样蛋白聚集和纤维形成的实验研究

发布时间：2020-04-17 18:13

【摘要】： 背景阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种神经退行性疾病,其发病率随年龄的增大而逐年增加,随着人口老龄化进程的加快,老年性疾病已成为一个明显影响人类健康的突出问题。阿尔茨海默病和心脏病、癌症和中风并列为威胁人类健康的四大疾病。而现有的治疗方法如神经递质替代、神经生长因子和脑细胞活化剂等的治疗,主要是改善症状,延缓病情发展,尚未取得令人满意的效果。寻找针对病因的治疗药物,是AD治疗的关键。β-淀粉样蛋白(β-Amyloid protein,Aβ)是老年斑(Senile Plaques,SP)中的主要成份,它的聚集被认为是导致阿尔茨海默发病的始发因素。以Aβ为靶的治疗策略是指导药物研究的一个极具希望的方向,它有别于以改善神经元功能或临床症状为主的治疗方法,而是针对引起AD发病的病理因素进行治疗。本研究根据Aβ_(1-42)的化学结构、形成过程和聚集原理设计出6种具有所期望的稳定性、溶解性和活性的多肽抑制剂,用于阻止可溶性β-淀粉样蛋白寡聚体和β-淀粉样蛋白斑块的形成。再通过以Aβ为靶进行的药物筛选,确定出H102,并在体外观察其对Aβ聚集的影响和对Aβ诱导神经细胞损伤的保护作用以及脑室注射H102对转基因小鼠脑内淀粉样前体蛋白(Amyloid Precursor Protein,APP)、Aβ表达的影响,为H102作为抗AD药物开发提供了重要的前期实验依据。本研究共分为三个部分:(-)分子水平药物筛选及H102对Aβ_(1-42)聚集的影响;(二)细胞水平药物筛选及H102对神经细胞的营养和保护作用;(三)H102对APP转基因小鼠脑内APP和Aβ表达的影响。材料和方法 (一)分子水平药物筛选及H102对Aβ_(1-42)聚集的影响 1.药物筛选将上述6种多肽抑制剂和维生素E(Vitamin E,VE)在相同剂量(88.61μmol/L)和孵育条件下(37℃24h)与Aβ_(1-42)(22.15μmol/L)共同孵育,取样进行Th-T检测,比较6种药物干预Aβ_(1-42)聚集的差别。 2.H102抑制Aβ聚集的研究 2.1量效关系研究用不同浓度(20μmol/L,40μmol/L,88.61μmol/L,200μmol/L)的H102和VE各10μl与(22.15μmol/L)的Aβ_(1-42)10μl在37℃24h条件下共同孵育,取样做Th-T检测,以研究其抑制Aβ聚集的量效关系曲线变化。 2.2时效关系研究Aβ_(1-42)10μl分别加入H102或VE各10μl(Aβ终浓度为11.07μmol/L,H102和VE终浓度为44.30μmol/L)37℃共同孵育,分别于孵育的12h、1d、3d、5d、7d取样作Th-T检测,分析其干预Aβ聚集的时效关系曲线变化。 3.电镜观察验证药物将上述6种多肽抑制剂在相同剂量(88.61μmol/L)和孵育条件下(37℃5d)与Aβ_(1-42)(22.15μmol/L)共同孵育。作透射电镜观察Aβ单独孵育后的聚集以及药物干预后对Aβ聚集、纤维形成的影响。 (二)细胞水平药物筛选及H102对神经细胞的营养和保护作用体外培养SY5Y细胞,以MTT代谢率测定细胞存活率作为筛选指标,筛选出具有保护神经细胞SY5Y作用的多肽抑制剂。 1.多肽抑制剂对神经细胞的营养作用分为正常对照组、多肽抑制剂K7、L5、H100、H101、H102、H103 10μmol/L组、20μmol/L组、40μmol/L组; 2.多肽抑制剂对Aβ诱导的细胞损伤的保护作用分为正常对照组、Aβ_(1-42)损伤组、Aβ_(1-42)+多肽抑制剂K7、L5、H100、H101、H102、H103 10μmol/L组、20μmol/L组、40μmol/L组; 3.H102的神经营养作用实验分为对照组、20μmol/L H102组; 4.H102的神经保护作用实验分为对照组、Aβ_(1-42)损伤组、Aβ_(1-42)+H102组。以MTT代谢率测定细胞存活率、细胞计数观察细胞增长情况、LDH漏出率观察细胞死亡率和形态学观察H102对神经细胞生长的影响。 (三)H102对APP转基因小鼠脑内APP和Aβ表达的影响 APP转基因小鼠,给予H102侧脑室注射3μl/d,10d后,运用刚果红和神经免疫组织化学技术方法染色,测定模型动物脑内APP、Aβ的表达水平。结果 (一)分子水平药物筛选及H102对Aβ_(1-42)聚集的影响 1.药物筛选初步分析以老化组的去本底荧光强度为100%,计算出各组药物对Aβ_(1-42)的聚集和纤维形成的抑制率。最后选择对Aβ具有良好抑制聚集和纤维形成的H102进行下一步的实验分析。 2.H102药效学研究 H102和VE可以明显抑制Aβ_(1-42)的聚集,对Aβ聚集的抑制均有浓度依赖性,H102在每一浓度点的抑制率均大于VE;时效依赖关系显示给药各组各时间点荧光强度均较Aβ组明显减弱,以H102的减弱最明显。曲线半高峰出现时间(T_(1/2)),Aβ在给药后第3天,而H102和VE则推迟至第4天左右。 3.电镜观察 Aβ_(1-42)在PBS溶液中单独孵育具有自发聚集倾向:单独孵育37℃5d,有大量Aβ纤维形成,直径约8～10nm,长0.5～5μm,呈芒刺式晶状聚集,有分枝,甚至交织成网状,其间夹杂着少量呈聚集状态的无定形结构;K7与Aβ_(1-42)共同孵育5d,出现大量Aβ纤维,直径约10～12nm,长0.5～3μm,呈芒刺式晶状聚集,有分枝,有交织成网状的趋势,其间可见大量呈聚集状态的无定形结构;L5与Aβ_(1-42)孵育5d,形成的Aβ纤维明显较细,直径约4～8nm,长0.3～5μm,交织成网状,其间夹杂着极少量呈聚集状态的无定形结构;H100与Aβ_(1-42)孵育5d,形成大量Aβ纤维,直径约10～18nm,长0.3～3μm,有交织成网状的趋势,可见大量呈聚集状态的无定形结构;H101与Aβ共同孵育5d,有少量Aβ纤维形成,直径约5～8nm,长0.5～5μm,交织成网状,其间可见极少量呈聚集状态的无定形结构;H102与Aβ共同孵育5d,Aβ纤维形成明显减少且直径变细,约3～6nm,长0.3～3μm,交织成网状,其间夹杂着极少量呈聚集状态的无定形结构;H103与Aβ共同孵育5d,少量Aβ纤维形成,直径约5～8nm,长0.5～5μm,呈芒刺式晶状聚集,交织成网状,其间夹杂着少量呈聚集状态的无定形结构。可见,H102抑制Aβ聚集和纤维形成的效果最好。 (二)细胞水平药物筛选及H102对神经细胞的营养和保护作用 6种多肽抑制剂中有4种可使SY5Y细胞MTT代谢率增高,以H102的效果最好,可使SY5Y细胞MTT代谢率增高,LDH漏出率减少,细胞数量增加。Aβ_(1-42)对培养的神经元具有毒性作用,表现为抑制细胞生长,MTT代谢率下降。6种多肽抑制剂都可以减轻Aβ_(1-42)引起的神经元损伤,以H102效果最明显,可使MTT代谢率升高,LDH漏出率减少,细胞数量增加,死细胞减少。提示H102具有神经营养和保护作用。 (三)H102对APP转基因小鼠脑内APP和Aβ表达的影响 9月龄转基因小鼠随机分组分为模型组、药物注射组、同月龄同背景C57BL/6J小鼠正常对照。药物注射组侧脑室给药,其他两组小鼠注射等体积生理盐水,给药10次后处死取鼠脑检测:石蜡切片观察刚果红染色;免疫组化观察APP、Aβ改变。提示H102可以降低APP转基因小鼠脑内APP、Aβ表达水平。结论药物筛选出H102对Aβ的β-折叠、聚集、纤维形成有很强的干预作用,并且对神经细胞具有营养和保护作用。具体表现在:(1)干预Aβ聚集、纤维形成过程;(2)对Aβ_(1-42)诱导损伤的SY5Y细胞具有保护作用;(3)降低APP转基因小鼠脑内APP、Aβ表达水平。
【图文】：

荧光强度,药物,相对荧光强度,科技攻关

本实验结果显示，Ap，、:老化组、Apl42十H102组和Apl二+vE组的荧光强度分别为112.79、81.39、84.76。以老化组的荧光强度为100%，，则各组的相对荧光强度见图1一1，H102和VE相对荧光强度分别为72.16%和75.巧%，由此推断H102和vE对Ap纤维形成的抑制率分别为27.84%和24.85%。一一”补亩一一一~一一勤勤·8}.一 ...;;;….井「讨… … AAApHD102VEEE图1一1药物对Ap荧光强度的影响天津市科技攻关培育项目USYFGPGXO71005

纤维结构,透射电镜观察,芒刺,晶状

单独孵育5d，出现大量Ap纤维，直径约8一10lun，长0.5~5娜，呈芒刺式晶状聚集，有分枝，甚至交织成网状，其间夹杂着少量呈聚集状态的无定形结构，(图1一4A，B);K7与Apl、共同孵育5d，有大量Ap纤维形成，并聚集成直径约10一12lun，长0.5一3脚，呈芒刺式晶状聚集，有分枝，有交织成网状的趋势，其间可见大量呈聚集状态的无定形结构，(图1一4c);L5与Ap孵育5d，形成的Ap纤维明显较细
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R749.16

【参考文献】