Aβ对大鼠海马神经元损伤及UCP2表达意义的初步研究

发布时间：2020-04-18 11:23

【摘要】： 目的:研究Aβ对体外培养大鼠海马神经元的毒性作用,及UCP2在Aβ诱导海马神经元损伤中的可能作用。阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种以损害大脑记忆和认知功能为主的中枢神经系统变性疾病,发病机制目前还不是很清楚。现有大量实验结果和临床资料表明Aβ是各种病因诱发AD的共同通路,是AD形成和发展的关键因素,而自由基损伤是Aβ的主要毒性机制。自由基氧化应激增强会导致脂质、蛋白质和DNA的损伤,而且因为高的代谢率、低水平的抗氧化剂、再生能力差等多种原因神经元很容易受到自由基的影响。解偶联蛋白2(uncoupling protein 2, UCP2)是线粒体内膜解偶联蛋白家族成员,广泛分布于人类及啮齿类动物的多种器官。目前,UCP2的生理功能尚不十分清楚,较多研究表明,UCP2可通过“质子漏”及氧化磷酸化解偶联作用,降低ROS产生,对细胞形态、功能起到保护作用。因此,我们推测UCP2可能通过其降低ROS的功能,对Aβ诱导大鼠海马神经元损伤有保护作用。方法:选用出生24小时内的SD大鼠,无菌分离并培养海马神经元,倒置显微镜进行形态学观察,培养至9-10天,经冷丙酮固定后,尼氏染色鉴定神经元。将终浓度分别为5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L Aβ_(1-40)加入到培养9天的海马神经元中,共同孵育24小时。观察Aβ_(1-40)对海马神经元的毒性作用,台盘兰染色法鉴定神经元的存活率,检测细胞上清液中乳酸脱氢酶和一氧化氮含量的变化。免疫细胞化学法观察UCP2的定位与表达变化。结果: 1.原代培养大鼠海马神经元,倒置显微镜进行形态学观察,尼氏染色鉴定神经元,细胞胞浆内蓝紫色颗粒及明显的空泡状核,为神经元所特有,占细胞总数90%以上。细胞的数量与状态可用于本研究。 2.不同浓度Aβ_(1-40)损伤海马神经元后,台盘兰染色结果显示10μmol/L和20μmol/L Aβ_(1-40)损伤组与其它组相比有显著性差异,细胞存活率明显下降(n=3, P0.001);20μmol/L Aβ_(1-40)损伤组细胞上清液中LDH明显增加,与其他组相比有显著性差异(n=4, P0.05)。 3. 20μmol/L Aβ_(1-40)损伤组细胞上清液中NO明显增加,与其它组相比有显著性差异(n=4, P0.05)。 4.免疫细胞化学结果显示UCP2在海马神经元胞浆中有表达。5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L Aβ_(1-40)损伤海马神经元后,神经元胞浆内出现棕黄色UCP2阳性染色颗粒,其中20μmol/L Aβ_(1-40)损伤组阳性颗粒尤其丰富,平均相对光密度与其他组相比有显著性差异(P0.05)。 5. Aβ_(1-40)损伤海马神经元后,将NO与LDH、UCP2与NO做相关性分析,结果表明:在Aβ_(1-40)终浓度小于20μmol/L时,NO与LDH之间存在显著正相关(n=4, P 0.001, r=0.864),UCP2与NO之间存在显著正相关(n=4, P 0.001, r=0.799)。结论: 1.Aβ_(1-40)对海马神经元有损伤作用,自由基的产生增加可能是其损伤途径之一。 2.在Aβ_(1-40)致海马神经元损伤中,UCP2可能通过降低活性氧的产生对海马神经元起保护作用。
【图文】：

原代培养,海马神经元,神经元,细胞存活率

图 1 原代培养大鼠海马神经元Fig. 1 The mature neurons in the primary hippocampal culture system. A: Normal neurons B:Hippocampal neurons stained with Thionine staining. (original magnification, ×400).二、Aβ1-40对海马神经元损伤作用形态学观察显示，20μM Aβ1 - 40作用神经元 24h 后，细胞出现皱缩，轮廓模糊不清，胞质染色变深，，核仁不明显等特点。台盘兰染色结果显示，存活神经元拒染，死亡神经元蓝染。正常对照组海马神经元存活率为 89.00±1.00%，5μmol/L、10μmol/L、20μmol/LAβ1 - 40损伤组海马神经元存活率分别为 86.00±2.00%，61.67±0.58%，53.33±3.06%。其中对照组和 5μmol/L Aβ1 - 40损伤组细胞存活率没有显著性差异，10μmol/L 和 20μmol/L Aβ1 - 40损伤组细胞存活率明显下降(n=3,P<0.001）。由表 1、图 2 可以看出，不同浓度 Aβ1 -4 0作用海马神经元后，LDH含量均有变化，其中 20μmol/L Aβ损伤组细胞液中 LDH 含量明显增高，

免疫细胞化学,海马神经元

13图 4 Aβ1 - 4 0损伤海马神经元 24h 后 UCP2 表达免疫细胞化学Fig.4 The changes of UCP2 in hippocampal neurons exposed to Aβ1 - 4 0for 24h. Aindicated positive control group. B, C, and D indicated 5μM , 10μM , 20μM of Aβgroup respectively. E indicated negative control group. (original magnification, ×100, ×400). Scale bar, 30μm.
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R749.16

【引证文献】