小鼠TREM2基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

发布时间：2020-04-20 02:24

【摘要】：目的构建小鼠髓样细胞触发受体-2(The triggering receptor expressed on myeloid cells-2,TREM2)基因过表达和短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰慢病毒载体,并通过对小鼠BV2小胶质细胞感染进行鉴定。方法1.小鼠TREM2基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定采用聚合酶链反应(PCR)扩增TREM2基因片段,将扩增产物连接至经Age I酶切后的线性化GV358载体,转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞,经PCR方法鉴定正确后行DNA测序比对分析。将测序正确的重组慢病毒质粒和包装质粒共转染至293T细胞进行包装并用荧光法行滴度测定。将成功包装的过表达慢病毒感染小鼠BV2小胶质细胞,Q-PCR检测感染后细胞中TREM2 mRNA的表达水平。2.小鼠TREM2 shRNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定针对小鼠TREM2基因设计合成3对shRNA序列,将其分别连接至经双酶切后的线性化GV248载体,转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞,筛选出阳性克隆后通过DNA测序进行鉴定。将测序正确的重组慢病毒质粒和包装辅助质粒共转染至293T细胞进行包装并用荧光法行滴度测定。将成功包装的3种shRNA干扰慢病毒载体分别感染小鼠BV2小胶质细胞,通过Q-PCR和Western blotting分别检测感染后各组细胞中TREM2 mRNA和蛋白的表达水平。结果1.小鼠TREM2基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定通过PCR成功获得TREM2基因片段并连接至线性化GV358载体上,通过PCR及DNA测序鉴定均证实重组慢病毒载体携带有正确的TREM2基因。在293T细胞中包装获得慢病毒并用荧光法测定其滴度为2.0×10~8 TU/mL。重组慢病毒载体感染小鼠BV2小胶质细胞后,Q-PCR检测结果显示,与空白对照组和阴性对照慢病毒感染组相比,过表达慢病毒感染组细胞中T REM2基因mRNA的表达水平显著升高(p0.05)。2.小鼠TREM2 shRNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定测序证实3种TREM2基因shRNA干扰慢病毒载体均构建成功。在293T细胞中包装获得慢病毒并用荧光法测定病毒滴度分别为4×10~8 TU/mL、4×10~8 TU/mL和5×10~8 TU/mL。重组慢病毒载体感染小鼠BV2小胶质细胞后,Q-PCR和Western blotting检测结果显示,与空白对照组和阴性对照慢病毒感染组相比,3种TREM2基因shRNA干扰慢病毒感染组细胞中TRE M2基因mRNA和蛋白的表达水平均下调(p0.05),其中GV248-shRNA-TR EM2-2感染组的沉默效率最佳,沉默效率达79.7%。结论我们利用慢病毒载体介导基因过表达以及RNA干扰的方法成功构建了小鼠TREM2基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体,并在小鼠BV2小胶质细胞中进行鉴定,为揭示TREM2基因参与晚发型阿尔茨海默病(late-onse t Alzheimer's disease,LOAD)发生发展的作用机制奠定了实验基础。
【图文】：

GV358载体信息

TREM2 基因 PCR 扩增产物的琼脂糖凝l electrophoresis of PCR amplification proV358 经 Age I 酶切后，，行琼 1-3）。平板上挑取菌落做 PCR 鉴定克隆，载体大小与预期相符果的阳性克隆行 DNA 测序分析
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R749.16

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本文编号：2634032