硫化氢对PC12细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制的探讨

发布时间：2020-04-25 15:03

【摘要】： 目的:以H_2O_2损伤PC12细胞为神经细胞氧化应激损伤的模型,探讨硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)对神经细胞氧化应激损伤的保护作用,并初步探讨硫化氢抗神经细胞氧化应激损伤的机制。 方法:用普通光镜和Hoechst 33258荧光染色观察H_2O_2作用24h后PC12细胞形态和核形态的变化;用四甲基偶氮唑蓝(3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide,MTT)比色法检测细胞增殖状况;DNA Ladder抽提试剂盒和碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测细胞凋亡;双氢罗丹明123(Dihydrohodamine 123, DHR123)染色后,镜下观察和FCM测定PC12细胞的DHR123荧光强度,以明确细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量的变化情况;罗丹明123(Rhodamine 123, Rh123)染色后,镜下观察和FCM测定PC12细胞的Rh123荧光强度,以了解细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,△Ψm)的变化情况;Western Blot检测细胞Bcl-2和Caspase-3蛋白质的表达。 结果: 1.H_2O_2对PC12细胞的氧化应激损伤作用:①MTT结果显示,用不同剂量H_2O_2(50、100、200、400、600μmol/L)作用PC12细胞24h后,细胞存活率随药物浓度的增加依次下降。②普通光学显微镜下观察发现,与正常细胞比较,细胞经H_2O_2( 200、400μmol/L )处理24h后,细胞数明显减少,细胞形态多为圆形,体积缩小,折光性减弱,贴壁能力降低。③细胞经Hoechst 33258染色后,在荧光显微镜下观察发现,正常PC12细胞染色质分布均匀,为弥漫均匀的低强度荧光;经H_2O_2( 200、400μmol/L )处理24h后,PC12细胞有大量的细胞核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光的凋亡细胞。④细胞经PI染色FCM结果显示,PC12细胞自然凋亡率为3.2%,经200和400μmol/L H_2O_2处理24小时后,分别可引起28.4%和45.1%的细胞凋亡(P0.01)。 2.H2S对H_2O_2损伤PC12细胞的保护作用 2.1 H2S减轻H_2O_2对PC12细胞活性的抑制作用 ①MTT结果显示,400、800μmol/L NaHS均可明显降低200、400μmol/L H_2O_2对PC12细胞的抑制率(P0.05)。 ②普通光学显微镜观察发现,与H_2O_2(200μmol/L )损伤组比较,合用NaHS(400μmol/L)处理后,圆形的,体积缩小的,折光性减弱,贴壁能力降低的PC12细胞数量明显减少。 2.2 H2S对抗H_2O_2诱导PC12细胞凋亡 ①DNA Ladder结果显示,200μmol/L H_2O_2作用PC12细胞24h后,细胞的DNA被裂解,在琼脂糖凝胶电泳图上呈现典型的梯形条带,合用400μmol/L NaHS处理后能明显抑制DNA梯带的形成。 ②Hoechst 33258染色荧光显微镜观察发现,与H_2O_2(200μmol/L)损伤组比较,合用NaHS (400μmol/L)处理的PC12细胞中细胞核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光的细胞数明显减少,大部分细胞染色质呈弥漫均匀的低强度荧光。 ③FCM结果显示,400和800μmol/L NaHS均可明显抑制200和400μmol/L H_2O_2对PC12细胞凋亡的诱导作用(P0.05)。 3.H2S抗PC12细胞氧化应激损伤的作用机制 ①PC12细胞经DHR123染色后,荧光显微镜观察发现,200μmol/L H_2O_2孵育PC12细胞3h后,合用400μmol/L NaHS处理的PC12细胞的DHR123荧光强度较200μmol/L H_2O_2损伤组明显减弱;FCM定量分析结果显示,合用400μmol/L NaHS处理的PC12细胞的DHR123平均荧光强度(8.03±2.08)较200μmol/L H_2O_2损伤组(13.81±2.52)明显降低(P0.01)。表明H_2S对H_2O_2诱导细胞内ROS的生成具有抑制作用。 ②PC12细胞经Rh123染色后,荧光显微镜观察发现,200μmol/L H_2O_2孵育PC12细胞6h后,合用400μmol/L NaHS处理的PC12细胞的Rh123荧光强度较200μmol/L H_2O_2损伤组明显增强;FCM定量分析结果显示,合用400μmol/L NaHS处理的PC12细胞的Rh123平均荧光强度(16.13±9.5)较200μmol/L H_2O_2损伤组(10.2±5.57)明显升高(P0.01)。表明H_2S对H_2O_2降低PC12细胞的△Ψm具有抑制作用。 ③Western Blot结果显示,200μmol/L H_2O_2孵育PC12细胞24h后,与正常对照组相比,Bcl-2蛋白的表达明显减少,合用400μmol/L NaHS能显著减轻H_2O_2对Bcl-2蛋白表达的抑制作用。 ④Western Blot结果显示,200μmol/L H_2O_2孵育PC12细胞24h后,与正常对照组相比,Caspase-3蛋白的表达明显增加;合用400μmol/L NaHS后,与H_2O_2损伤组比较,PC12细胞的Caspase-3蛋白的表达明显降低。 结论:1. H_2S对H_2O_2诱导的PC12细胞氧化应激损伤具有保护作用; 2. H_2S对PC12细胞氧化应激损伤的保护作用可能与其抑制H_2O_2作用后细胞内ROS水平的升高,细胞△Ψm和Bcl-2表达的下降以及Caspase-3表达的增加有关。
【图文】：

H2O2+NaHS NaHS图 6 H2S 对 PC12 细胞形态的影响（10×10）Fig 6 Effect of H2S on shape of PC12 cellsH2O2: 200μmol/L, NaHS: 400μmol/L2.2 H2S 对抗 H2O2诱导 PC12 细胞凋亡 H2S 对 H2O2诱导 PC12 细胞 DNA 片断化的影响采用 DNALadder 试剂盒，检测 H2S 对 H2O2诱导的 PC12 细胞 DNA 片断化的果如图 7 所示，PC12 细胞经 200μmol/L H2O2作用 24 后，细胞的 DNA 被裂解，，糖凝胶电泳图上呈现典型的梯形条带，而合用 400μmol/L NaHS 处理后，能明显A 梯带的形成；正常组与 NaHS 处理组的 PC12 细胞均未出现 DNA 梯带。表明

图 7 H2S 抑制 H2O2诱导的 PC12 细胞 DNA 片断化g 7 H2S rescues DNA fragmentation of PC12 cells induced by HH2O2: 200μmol/L, NaHS: 400μmol/LH2O2诱导 PC12 细胞核形态变化的影响oechst 33258 染色后，荧光显微镜观察细胞核的形态。aHS 处理组的 PC12 细胞染色质分布均匀，为弥漫均匀O2作用 24h 后，PC12 细胞有大量的细胞核呈浓染致密细胞，而合用 400μmol/L NaHS 处理的 PC12 细胞中细粒状荧光的细胞数明显减少，大部分细胞染色质呈弥漫HO诱导 PC12 细胞凋亡的影响M control H2O2H2O2NaHSNaHS
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R749.16

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 朱小雨;;硫化氢与高血压[J];心血管病防治知识;2009年01期

2 徐冰馨;高平进;;硫化氢与高血压[J];中国分子心脏病学杂志;2011年04期

3 郝凯瑞;;柴油加氢装置生产过程中职业病危害因素调查[J];安全、健康和环境;2011年06期

4 陈雯;张颖;齐迎春;任青爱;杨靖;邓昭阳;谢晓华;;硫化氢对大鼠骨骼肌缺血再灌注所致心肌损伤的保护作用[J];中华保健医学杂志;2011年03期

5 李毅;王一贺;;硫氢化钠对烧伤大鼠血清中一氧化氮含量的影响[J];中华损伤与修复杂志(电子版);2011年03期

6 张晓荣;戎小平;;硫化氢及血红素氧合酶-1在先天性心脏病肺动脉高压中的作用探讨[J];临床儿科杂志;2011年07期

7 马微;车艳娟;姜艳;;硫化氢对脂肪细胞前体增殖的影响[J];牡丹江医学院学报;2011年03期

8 刘俊;郝丹丹;朱依纯;;硫化氢对大鼠心脏成纤维细胞增殖的抑制作用[J];生理学报;2011年04期

9 田云朋;王虹艳;曲鹏;牛楠;陈亮;;老年缺血性心力衰竭患者血浆硫化氢水平变化[J];中华高血压杂志;2011年06期

10 李艳兵;钟光珍;杨新春;刘秀兰;;硫化氢对大鼠心房肌细胞三磷酸腺苷敏感性钾通道电流的影响[J];中国心脏起搏与心电生理杂志;2011年03期

相关会议论文 前10条

1 吴代琴;方颖;;肾血管性高血压大鼠中硫化氢体系的实验观察[A];贵州省医学会内科学分会2007年学术年会专题讲座及论文汇编[C];2007年

2 孙燕;杜军保;;硫化氢对体循环和肺循环血管舒张效应调节作用及其机制[A];中华医学会第十五次全国儿科学术大会论文汇编（上册）[C];2010年

3 胡盛华;陈邦林;韩庆平;陆维昌;;溶胶凝胶法制备硫化氢气敏材料(SnO_2)[A];中国化学会第十届胶体与界面化学会议论文摘要集[C];2004年

4 王晓明;汪树军;刘红研;厉建祥;;电化学溶解-沉淀法回收硫化氢制备氢气和硫化锌的研究[A];第九届全国化学工艺学术年会论文集[C];2005年

5 孙燕;金红芳;杜军保;唐朝枢;;硫化氢对体循环和肺循环血管舒张效应调节作用及其机制[A];第八届海峡两岸心血管科学研讨会论文集[C];2011年

6 戴鸿雁;凌亦凌;黄新莉;杨世方;王秋红;;硫化氢对内毒素血症大鼠肺动脉反应性的调节作用及其与NO的关系[A];第六次全国缺氧和呼吸病理生理学术会议论文摘要汇编[C];2003年

7 相春娥;柴永明;柳云骐;刘晨光;;原位产生的H_2S对二苯并噻吩加氢脱硫反应的影响[A];第十三届全国催化学术会议论文集[C];2006年

8 方恒荣;唐小卿;;抑制内源性硫化氢的生成加剧甲醛的神经毒性[A];中南地区第八届生理学学术大会论文摘要汇编[C];2012年

9 孟涛;晏勇;张华;代政伟;;胰岛素生长因子-1对CBS和硫化氢的作用及相关机制研究[A];中华医学会第十三次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2010年

10 郭静;朱珂;黄海耀;刘学欣;;生物膜反应器对硫化氢和甲苯的净化效率比较[A];恶臭污染测试与控制技术——全国首届恶臭污染测试与控制技术研讨会论文集[C];2003年

相关重要报纸文章 前10条

1 记者 付东红;硫化氢可缩小动脉粥样硬化斑块[N];健康报;2008年

2 孙维生;硫化氢[N];中国化工报;2004年

3 中国医学科学院药用植物研究所研究员 郭伽;硫化氢具有重要的生理功能[N];健康报;2009年

4 内蒙古民族大学动物科技学院 王亮;硫化氢[N];江苏农业科技报;2006年

5 赵士振　袁滨;油井硫化氢防控安上“警灯”[N];中国石化报;2009年

6 记者 彭展　通讯员 彭森林;巴陵硫化氢处理项目开工[N];中国石化报;2010年

7 时尤;工艺不合理 硫化氢致死[N];中华合作时报;2004年

8 记者 邱美辉;安监总局首次通报施救不当事故[N];中国化工报;2007年

9 冯文 薛金荣;宝钢、珠管合作研发出抗硫化氢直缝焊管[N];中国冶金报;2006年

10 卫报;硫化氢夺命不露声色[N];大众卫生报;2003年

相关博士学位论文 前10条

1 李洪民;基于微流控芯片的细胞内活性氧（O_2~（·-）、H_2O_2）多组分的同时分析[D];山东师范大学;2012年

2 鹿文葆;褪黑素对H_2O_2诱导的大鼠脑微血管周细胞损伤的影响[D];北京协和医学院;2012年

3 王岩;养心汤含药血清对H_2O_2诱导内皮损伤模型差异基因及ST3GAL2mRNA表达的影响[D];黑龙江中医药大学;2010年

4 李杨;养心汤含药血清对H_2O_2诱导内皮损伤模型差异基因及Smad4 mRNA表达的影响[D];黑龙江中医药大学;2010年

5 甄爱;耐盐砧木嫁接调控H_2O_2清除系统提高黄瓜幼苗耐盐性的机制[D];华中农业大学;2011年

6 付志方;新型气体信号分子硫化氢在大鼠肺缺血再灌注损伤中的作用及其机制探讨[D];北京大学;2008年

7 庞素艳;铁锰催化H_2O_2、KHSO_5、KMnO_4氧化降解酚类化合物的效能与机理研究[D];哈尔滨工业大学;2011年

8 张智;恶劣环境油井管腐蚀机理与防护涂层研究[D];西南石油学院;2005年

9 崔晓辉;硫化氢在大鼠内毒素休克发生发展中的作用及其对一氧化氮和一氧化碳的影响[D];河北医科大学;2007年

10 马健;杨树（Populus spp.）与茶呰子葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）互作中SA和H_2O_2的信号转导特征[D];中国林业科学研究院;2012年

相关硕士学位论文 前10条

1 伍小兵;H_2O_2对甘薯幼苗不定根的生长和植株抗冷性的影响[D];西北农林科技大学;2010年

2 赵红叶;基于三种新型复合纳米材料的H_2O_2电化学生物传感器研究[D];西北大学;2011年

3 张晶;远志皂苷元对H_2O_2诱导大鼠海马神经元损伤的影响及机制研究[D];暨南大学;2011年

4 尹建波;TS-1催化H_2O_2环氧化苯乙烯的优化[D];大连理工大学;2010年

5 马伟凤;石斛提取物及丁香酸对H_2O_2损伤的HLEC的防护作用[D];广州中医药大学;2010年

6 徐玲;6-氟基丁基苯酞对H_2O_2诱导的PC12细胞氧化损伤的保护作用及其机制研究[D];河南大学;2010年

7 王玮;H_2O_2氧化糖蜜酒精废液过程中组分的变化规律[D];广西工学院;2010年

8 陈红霞;二氮嗪预处理对H_2O_2损伤L6骨骼肌成肌细胞的作用[D];河北医科大学;2011年

9 王培;白藜芦醇对自然衰老小鼠H_2O_2含量和ATP酶活力影响的实验研究[D];辽宁中医药大学;2010年

10 陈琪;邻甲苯胺的电子转移机理及组分协同效应研究[D];曲阜师范大学;2006年

本文编号：2640370