Aβ3-10疫苗早期免疫治疗对Alzheimer病β-淀粉样蛋白的影响

发布时间：2020-04-26 21:15

【摘要】：目的:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是老年痴呆中最常见的一种类型,是一种以记忆障碍、认知障碍、执行功能障碍等为主要表现的渐进性神经退行性疾病。主要病理表现为淀粉样蛋白(amyloid beta,Aβ)沉积,微管相关tau蛋白磷酸化形成神经纤维缠结、突触功能受损,神经元丢失和神经炎症反应。针对AD发病的原因尚未明确,其中“淀粉样蛋白级联假说”目前受到广泛的认可。假说认为淀粉样蛋白沉积是AD的起病和发展中的中心环节,AD患者机体本身对淀粉样蛋白的清除和蛋白产生之间的失衡诱导了淀粉样蛋白的沉积,继而引起突触损伤、tau蛋白磷酸化、神经炎症反应和神经元坏死等特征性的病理变化。起初人们一直把研究的重点聚焦到清除淀粉样斑块上,然而随着研究的不断深入,许多实验结果都证实了清除淀粉样蛋白斑块并不能很好的改善阿尔茨海默病相关的病理改变。因此,Aβ寡聚体逐渐成为了新的研究热点。在“淀粉样蛋白级联假说”的基础上,有人提出了“淀粉样蛋白寡聚体级联假说”。清除已经形成的淀粉样斑块并不是治疗疾病的首要目的,预防淀粉样蛋白沉积具有更大的意义。目前临床上对阿尔茨海默病的治疗仍旧以控制疾病进展为主,以Aβ为靶点的主动和被动免疫治疗是基础试验中研究的主要方向。一些在动物模型上进行的Aβ相关疫苗试验取得了一定的效果,在接受免疫治疗后,实验动物的Aβ沉积减少,突触损伤和神经炎症反应得到了改善,并且认知学习功能也有所提高。科学家们将一些疫苗开展到临床试验中,但是大多数在前期就以失败告终。在针对AD的研究过程中,转基因动物模型的成功建立发挥着关键的作用。AD病理改变十分复杂,因此建立能够全面表达AD所有病理改变的动物模型具有很大的难度。最初人们使用较多为APP或tau单转基因和APP/PS1双转基因模型。直至2003年Oddo等人成功建立了APP/PS1/tau三转基因小鼠,使得研究Aβ与tau蛋白的相互作用关系得以实现。这个三转基因小鼠也是直到目前为止,与AD病理改变最相近的动物模型。小鼠表现为与年龄相关的病理变化,首先可以在脑组织中检测到Aβ产生,随着时间的增加,可以逐渐检测到突触受损、炎症细胞增多以及tau蛋白磷酸化的改变。突触可塑性异常和神经炎症反应都能引起认知功能的损伤,而这两种病理改变也是由上游的可溶性Aβ寡聚体所导致的。因此,通过早期的主动免疫治疗,有效的预防Aβ产生和清除Aβ成为本次的研究重点。同时在清除Aβ的基础上检测下游的突触损伤、tau蛋白和神经炎症反应的改善情况。研究方法:将合成的多肽疫苗Aβ3-10与血蓝蛋白KLH偶联,采用皮下注射的方式免疫三转基因(APP/PS1/tau)AD模型小鼠,从小鼠1月龄起开始注射,共进行7次免疫。另外一组小鼠以相同方式注射等量的PBS作为阴性对照。在第一次免疫前和每次免疫后通过小鼠内眦静脉采集一定量的血液,离心后取上层血清采用ELISA的方法检测Aβ抗体的浓度。在小鼠完成末次免疫后,经心脏生理盐水灌流取出脑组织,右脑用于制备脑匀浆ELISA法检测脑组织中可溶性和不可溶性Aβ蛋白以及tau蛋白的含量,并采用Western blot方法检测脑组织中Aβ寡聚体含量和突触相关蛋白的含量变化。左侧脑组织用4%多聚甲醛固定后通过免疫组化染色检测细胞内外Aβ蛋白和与炎症反应相关的小胶质细胞以及星形胶质细胞的活化程度,并与相同月龄的野生型背景小鼠相互比较。结果:随着免疫次数的增加,小鼠血清中抗体的浓度也逐渐升高,在Aβ3-10-KLH进行七次免疫后,小鼠体内产生了较高浓度的抗Aβ抗体。而没有接受免疫的小鼠虽然也有抗体产生,但维持在极低的水平。免疫后小鼠脑组织中可溶性和不可溶性的Aβ的含量均明显降低,tau蛋白含量也明显减少,Aβ寡聚体在Western blot检测里也表现为减少的趋势。通过Western blot检测突触前后膜相关的标记蛋白,未接受免疫治疗的小鼠脑组织中突触素、发动蛋白1、PSD-95以及NR2B受体的含量与野生型小鼠相比均有明显的下降,而免疫后的小鼠四种蛋白的含量均有所提升。免疫组化结果显示:免疫后小鼠脑组织细胞内外的Aβ含量都低于阴性对照组的转基因小鼠。PBS注射的小鼠脑组织中小胶质细胞和星形胶质细胞的活化程度明显高于野生型小鼠,而免疫后的小鼠脑组织中的活化的小胶质细胞和星形胶质细胞则明显少于PBS组小鼠。结论:1、在三转基因小鼠出现AD相关病理改变之前使用新型的Aβ多肽疫苗Aβ3-10-KLH对其进行免疫治疗,末次免疫后血清中产生了较高浓度的Aβ抗体。2、疫苗产生的抗体不仅能够减少与Aβ寡聚体相关的可溶性淀粉样蛋白,也能减少形成沉积斑块的不可溶性的淀粉样蛋白,和tau蛋白在脑组织中的含量。3、疫苗减少了APP/PS1/tau三转基因小鼠脑组织细胞内外Aβ蛋白的含量。4、疫苗对转基因小鼠脑组织的突触产生了有效的保护作用。5、疫苗减少了小胶质细胞和星形胶质细胞的活化,从而减轻了炎症反应的程度。6、我们使用Aβ多肽疫苗进行主动免疫治疗不仅减少了Aβ相关的病理改变,也改善了由Aβ继发的与AD关系密切的tau蛋白、突触及神经炎症的病理改变,为“淀粉样蛋白级联假说”的成立提供了依据。
【图文】：

小鼠血清,免疫后,抗体,浓度

中国医科大学博士学位论文疫吸附实验检测发现，免疫前小鼠血清中抗体的含量几乎为零；在第二次免疫Aβ3-10-KLH 组小鼠血清中的抗体浓度开始产生明显的升高，并随着免疫次数增加而逐渐升高；而 PBS 组小鼠虽然也检测到自身产生了一定量的抗体，但一直维持在一个很低的浓度在第七次免疫后，Aβ3-10-KLH 组小鼠血清中的体浓度为 44.77±41.91 μg/mL，而 PBS 组抗体的浓度仅为 2.21±0.89 μg/mL，且差异具有统计学意义（**P<0.01）（图 1）末次免疫后，Aβ3-10-KLH 组小鼠清中的抗体浓度具有较大的个体差异，其中最高值为 118.808 μg/mL，最低值16.45 μg/mL（图 2）

免疫后,小鼠,血清,抗体

图 2Aβ3-10-KLH 组每只小鼠最后一次免疫后血清中抗体的浓度早期 Aβ3-10-KLH 免疫治疗减少 APP/PS1/tau 三转基因小鼠的 Aβ1-x 含量淀粉样蛋白的出现是阿尔茨海默病的一种主要的病理特征，尤其是可溶疾病进展中发挥着重要的作用三转基因小鼠最早可于 2 月龄时检测蛋白的阳性反应在完成第七次免疫后处死小鼠并取出脑组织制备脑 ELISA 检测脑匀浆中可溶性和不可溶性 Aβ1-x（包括 Aβ1-42，Aβ1-40蛋白的含量，并将 Aβ3-10-KLH 组与 PBS 组的结果进行比较，结果显-10-KLH 免疫治疗不仅减少了可以产生毒性作用的可溶性的 Aβ1-x 的少了组成细胞外斑块沉淀的不可溶性的 Aβ1-x（图 3）其中可溶性的 40.24%，，差异具有统计学意义（*P＜0.05）；不可溶性的 Aβ 减少了 64.
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R749.16

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