氧感受神经元中的cGMP信号通路促进线虫酒精急性耐受的形成
发布时间：2020-05-09 21:51
【摘要】：酒精滥用是一种很普遍的社会现象。过量的酒精摄入引起酒精上瘾和酒精中毒等,对人类生命健康产生很大的危害并且导致了一系列严重的社会问题。理解酒精的作用机制对于治疗酒精引起的相关疾病非常重要。酒精对个体有着广泛的生理和行为影响,低剂量摄入会引起神经系统的兴奋,随着剂量的提升进而会引起镇定乃至酒精中毒等。动物还进化出了对酒精的急性耐受,也就是在体内或组织中酒精浓度没有显著改变的情况下,酒精中毒的症状可以在短时间内得到缓解恢复。但是其分子机制仍然不太清楚。线虫作为一种培养简单、容易观察、遗传操作方便的模式生物,有很多基因高度保守,特别是神经活动相关的基因。在线虫中可以很方便地研究神经系统中的基因的功能并解析神经回路,目前也只有线虫可以进行这么深入的研究。本研究中以线虫为模式生物研究调控酒精急性耐受性形成的分子机制和神经回路。在线虫中,NPR-1对线虫酒精耐受性的形成起负调控作用,在NPR-1高活性(215V)的虫系中,酒精耐受性的形成受到抑制,而在NPR-1低活性(215F)或者功能缺失的虫系(比如CB4856、npr-1(ad609))可以快速形成酒精耐受性。但是其分子机制和神经回路仍然不是很清楚。NPR-1在氧感受中也是起负调控作用。因此我们推测在线虫中,可能是由于氧感受神经回路功能的差异导致了酒精耐受性的差异。我们以此设想开展深入的研究。通过行为学实验我们发现了在NPR-1低活性(215F)或者功能缺失的虫系的酒精急性耐受性需要GCY-35/GCY-36--TAX-2/TAX-4信号通路,这个信号通路已经被证明参与氧的感受。意外的是,我们发现在NPR-1低活性(215F)或者功能缺失的虫系、N2(215V)等的酒精急性耐受性都与所处环境的氧浓度无关。通过活体钙成像实验发现酒精可以直接激活氧感受神经元URX、AQR等。进一步的基因突变和基因回复实验证实,酒精对URX神经元的激活也是需要GCY-35/GCY-36--TAX-2/TAX-4信号通路的参与。遗憾的是,我们在有cGMP门控阳离子通道蛋白异源二聚体TAX-2/TAX-4的神经元ASI和ASG中异位共表达gcy-35/gcy36的cDNA,并不能赋予这两个神经元对酒精做出钙反应的功能。因此仍然不确定GCY-35/GCY-36复合物是否是酒精的受体,也不确定在URX神经元中是否还有其他的酒精受体。最后通过化学遗传学的方法抑制氧感受神经元,也就是在氧神经元中外源表达组氨门控的氯离子通道HisCl1并加组氨激活该离子通道,我们发现氧感受神经元和下游神经回路的活化是NPR-1低活性(215F)或者功能缺失的虫系的酒精急性耐受性所必须。在野外,线虫以细菌等微生物为食物,生活在腐化的水果或植物根茎中,在这种环境下,由于微生物的代谢,往往氧含量较低,微生物可能会进行厌氧代谢,产生酒精。为了适应环境,经过进化,线虫通过同样的神经元和神经回路感受氧和酒精,对于线虫的生存和物种的繁衍有着重要的意义。
【图文】：
华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文为了在 RMG神经元中表达 npr-（1cDNA），我们用了 Cre-loxP重组反应系统[81]。其原理如图2.1，用启动子ncs-1p来驱动nCre酶的表达，同时在flp-21p启动子和npr-1（cDNA）直接插入 nCre 酶可以识别切割的两个位点 LoxP 位点，并且在两个 LoxP位点加入可以阻止基因转录翻译的 STOP 位点，因此只有同时表达了 nCre 酶的神经元，flp-21p 启动子才能驱动 npr-1 cDNA 的表达。通过这个 Cre-loxP 重组反应系统我们 可 以 在 RMG 中 特 异 性 地 表 达 npr-1 （ cDNA ）。 本 文 中 用 到 的 质 粒flp-21p::LoxStopLox::npr-1(cDNA)::sl2::GFP 和 ncs-1p::nCre 是 从 Cornelia I.Bargmann 实验室获得[81]。
. gcy-35/gcy-36 和 tax-2/tax-4 突变体的酒精初始敏感性和急性耐受性与 N2 野生型虫显著差异N2、gcy-35(ok769)、gcy-36(db42) 突变体酒精暴露 10 分钟和 30 分钟后的相对运动速/非酒精暴露）。（B）N2、tax-2(ky31)、tax-2(p694 和 tax-4(p678)突变体酒精暴露后0 分钟的相对运动速率（酒精暴露/非酒精暴露）。先通过双因素方差分析。）中，F时间(1, 34) = 3.984，P = 0.0540；F基因型(3, 34) = 1.406, P = 0.2579；F基因型 *时间2，P = 0.4040。）中，F时间(1, 36) = 12.79，P = 0.0010；F基因型(3, 36) = 3.227，P = 0.0337；F基因型 0.2743, P = 0.8435。过 Bonferroni t-test 进行检验（* p ≤ 0.05）。e3.1. gcy-35/gcy-36 and tax-2/tax-4 mutants displayed no significant difference in senand acute functional tolerance to ethanold (B) The relative locomotion speed (ethanol treated/untreated) at 10 and 30 min after exnol (500 mM) in (A) wild type N2, gcy-35(ok769), gcy-36(db42) mutants, (B) tax-2(ky31
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R749.62
【图文】：
华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文为了在 RMG神经元中表达 npr-（1cDNA），我们用了 Cre-loxP重组反应系统[81]。其原理如图2.1，用启动子ncs-1p来驱动nCre酶的表达，同时在flp-21p启动子和npr-1（cDNA）直接插入 nCre 酶可以识别切割的两个位点 LoxP 位点，并且在两个 LoxP位点加入可以阻止基因转录翻译的 STOP 位点，因此只有同时表达了 nCre 酶的神经元，flp-21p 启动子才能驱动 npr-1 cDNA 的表达。通过这个 Cre-loxP 重组反应系统我们 可 以 在 RMG 中 特 异 性 地 表 达 npr-1 （ cDNA ）。 本 文 中 用 到 的 质 粒flp-21p::LoxStopLox::npr-1(cDNA)::sl2::GFP 和 ncs-1p::nCre 是 从 Cornelia I.Bargmann 实验室获得[81]。
. gcy-35/gcy-36 和 tax-2/tax-4 突变体的酒精初始敏感性和急性耐受性与 N2 野生型虫显著差异N2、gcy-35(ok769)、gcy-36(db42) 突变体酒精暴露 10 分钟和 30 分钟后的相对运动速/非酒精暴露）。（B）N2、tax-2(ky31)、tax-2(p694 和 tax-4(p678)突变体酒精暴露后0 分钟的相对运动速率（酒精暴露/非酒精暴露）。先通过双因素方差分析。）中，F时间(1, 34) = 3.984，P = 0.0540；F基因型(3, 34) = 1.406, P = 0.2579；F基因型 *时间2，P = 0.4040。）中，F时间(1, 36) = 12.79，P = 0.0010；F基因型(3, 36) = 3.227，P = 0.0337；F基因型 0.2743, P = 0.8435。过 Bonferroni t-test 进行检验（* p ≤ 0.05）。e3.1. gcy-35/gcy-36 and tax-2/tax-4 mutants displayed no significant difference in senand acute functional tolerance to ethanold (B) The relative locomotion speed (ethanol treated/untreated) at 10 and 30 min after exnol (500 mM) in (A) wild type N2, gcy-35(ok769), gcy-36(db42) mutants, (B) tax-2(ky31
【学位授予单位】：华中科技大学
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【学位授予年份】：2018
【分类号】：R749.62
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本文编号：2656793
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