阿尔茨海默病中microRNA-34a作用机制的研究

发布时间：2020-05-15 19:12

【摘要】：AD是一种神经系统退行性疾病,是导致老年人痴呆的主要原因。据统计:美国AD患者为200-400万,全球1700-2500万。据最新城市普查结果,AD患病率高于血管性痴呆。在西方国家AD是继心脏病、肿瘤和中风之后,排在第四位的导致死亡的疾病。AD可延续20年,给个人、家庭、社会带来深重的负担和痛苦。AD的病因尚不明确,因此使得其治疗变得更为困难,目前针对这类患者尚未有十分有效的治疗方案。现有的研究表明,Aβ、Tau、PS和ApoE等均在AD的发病过程中起到重要作用,但令人遗憾的是,以上述几个方面做为靶点的治疗未能取得令人满意的效果。因此,我们有必要从新的角度来研究AD的发病机制,从而为其治疗提供新的思路。microRNAs(miRNAs)是一种内源性表达的非编码小RNA,其通过抑制靶mRNA的翻译或促进靶mRNA的降解调节基因的表达。随着对其研究的不断深入,人们发现miRNAs在各种生理或病理过程发挥着日益重要的作用。miRNA在脑组织中含量丰富,而且有些miRNA是脑组织所特有的,例如mir-124a和mir-134。miRNAs对于神经系统的发育和突触可塑性的形成起着重要作用。目前已有相关研究表明,miRNA功能的异常可能参与了各种神经退行性疾病的发生,包括帕金森病和阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)等。但是,miRNAs在AD中的具体作用机制目前还不明确。 mir-34a是mir-34家族的一个成员,这一家族包括3种互相关联的miRNAs:mir-34a、mir-34b和mir-34c。其中mir-34a由位于1号染色体p36.23的基因编码,而mir-34b/mir-34c基因簇则由位于11号染色体q23的基因编码。已有多篇文献报道mir-34a可以通过诱导细胞周期停滞、凋亡或老化抑制肿瘤的发生发展。此外,在人神经母细胞瘤和其它恶性肿瘤中,经常会出现mir-34a编码基因的杂合性缺失。目前,还未见有关mir-34a在AD中作用机制的报道。 Bcl2是一种抗凋亡蛋白,其通过与Apaf-1的结合抑制caspase-9的活性。已有研究表明,在阿尔茨海默病中,bcl2可以通过抑制caspase-9和caspase-3的活性来保护神经细胞免于凋亡或减轻病变程度。Caspase-3和caspase-9都是介导凋亡的重要因子,此外也有研究表明caspase-9和caspase-3可以促进Tau和APP的剪切,从而导致神经元纤维缠结的形成和细胞外淀粉样斑块的沉积。我们利用APPswe/PSΔE9双转基因小鼠作为研究阿尔茨海默病的模型,通过microRNA芯片和萤光定量PCR的方法,发现mir-34a在模型小鼠中表达水平明显升高,并且其表达水平与bcl2蛋白水平呈负相关。为了进一步研究两者之间的关系,我们构建了mir-34a的稳定转染细胞系,通过对这一细胞系的研究表明mir-34a过表达可以明显降低bcl2蛋白水平,但是其mRNA水平无明显变化,这提示我们bcl2很有可能是mir-34a的一个作用靶点。为了进一步验证我们的想法,我们利用针对mir-34a的反义寡核苷酸序列来抑制mir-34a的表达,并分析其对bcl2蛋白表达的影响,实验结果与我们预想的一致,当mir-34表达降低以后,bcl2蛋白水平明显升高,其mRNA水平无明显改变,这一结果进一步提示我们mir-34a可能作用于bcl2.为了证明bcl2 mRNA的3'UTR序列包含mir-34a作用的位点,我们将bcl2 mRNA的3'UTR序列克隆至萤光报告载体中,并与mir-34a表达载体共转染至SH-SY5Y细胞中,然后检测萤光素酶的活性,结果表明mir-34a的过表达可以明显抑制抑制萤光素酶的活性;与之相反,当我们将bel2 3'UTR-萤光素酶报告载体中mir-34a可能的结合位点采用定点突变的方法突变以后,再和mir-34a表达载体共转染至SH-SY5Y细胞中,萤光素酶的活性仅发生微弱的变化,这说明mir-34a可以直接作用于bel2。除了证明mir-34a和bcl2的关系以外,我们还检测了活化的caspase-9和caspase-3的表达情况。我们发现无论是在APPswe/PSΔE9小鼠中,还是在mir-34a的稳定转染细胞系中,活化的aspase-3和caspase-9的表达水平都明显升高。当我们抑制mir-34a表达以后,bcl2表达水平升高,与此同时,活化的caspase-3和caspase-9的蛋白水平明显降低,上述结果提示我们mir-34a可以通过调节bcl2的表达水平来影响caspase-3和caspase-9的激活。无论是bcl2还是caspase-3和caspase-9,它们都参与了AD的发生,我们的实验结果提示我们bcl2可能是mir-34a重要的功能靶点,mir-34a的过表达可能通过下调bcl2的蛋白水平,从而参与AD的发生。
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R749.161

【引证文献】