Alzheimer病Aβ3-10基因10次重复基因表达质粒的构建

发布时间：2020-05-16 23:24

【摘要】： 目的 阿尔茨海默病(AD)是老年性智力障碍与痴呆最常见的痴病。临床上以进行性记忆功能及认知功能的下降为特征,严重影响了患者的生活质量。目前该病的治疗主要是以对症治疗为主,尚无特效的治疗手段。因此关于阿尔茨海默病的研究具有重要意义。阿尔茨海默病确切的病因还不是很明确,目前以β淀粉样蛋白(Aβ)瀑布学说为主,该学说认为β淀粉样蛋白在大脑皮质、海马、嗅球等相关区域的异常大量沉积是导致阿尔茨海默病整个病理过程的最初和最关键步骤,而其他病理过程以及tau蛋白的过磷酸化都继之于此。一旦Aβ尤其以Aβ42为主异常沉积将会对脑细胞产生毒性作用,引起组织变性。一些Aβ免疫措施已经在AD模型鼠中实施,并发现有重要的临床研究价值。理论上主动及被动免疫都可以清除Aβ斑块,早期用Aβ免疫AD转基因鼠证实其能降低Aβ的病理沉积、推迟认知功能损害及改善记忆功能。基于大量动物实验结果,Ⅰ期临床试验在20个患者中实施。不幸的是Ⅱ期临床试验298人中有18人约6%产生了副反应—自身免疫性无菌性脑脊髓膜炎。目前已有研究认为Ⅱ期临床实验中的副反应可能与AβC-末端含有T细胞抗原表位导致了T细胞过度反应有关,因此在设计疫苗时应重点针对B细胞抗原决定簇以减少或消除T细胞反应。研究者应用N-末端片断免疫的结果表明小分子N-末端片段作为疫苗能有效清除Aβ斑块,并能避免炎症反应。因此我们构建的Aβ亚单位疫苗在设计上避免了T细胞的抗原决定簇,保留了B细胞抗原决定簇。尽管AD的免疫治疗遭遇挫折,但随着研究的深入发展,又给AD患者带来新的希望。疫苗没有引起动物的自身免疫反应,也不会影响神经系统的正常功能。研究发现普遍存在于细菌DNA中的非甲基化CPG序列具有强烈的免疫增强效应,人工合成CPG序列的寡核苷酸能够模拟细菌DNA中CPG的生物功能。其与蛋白类抗原联合应用可以有效的诱导机体产生免疫应答,具有免疫佐剂的作用。另外研究证实小肽段多次重复从而延长肽链能增强其抗原性。鉴于目前小肽段免疫原性弱的缺点,我们在实验设计中采用多次重复序列及同时应用CPGDNA,以提高重组子的免疫原性。为了寻求更安全,有效的疫苗我们构建阿尔茨海默病Aβ3-10和CPG基因表达质粒,探讨其是否能作为阿尔茨海默病的特异性疫苗,为进一步研究Aβ清除老年斑的机理和DNA疫苗的研制奠定了基础。 方法 在GenBank中查到Aβ3-10的cDNA序列,人工合成Aβ3-10-CPG基因片段上游加上cozak序列及上下游加酶切位点(上-EcoRI下-XhoI),CPG序列前加入酶切位点NotI,人工合成目的基因。以限制性内切酶EcoRV将POC57质粒切成平端,连接酶连接构建POC57-Aβ3-10-CpG载体,转化感受态菌DH-5α,挑取阳性克隆,质粒提取试剂盒提取质粒,测序验证。选择测序正确的与pcDNA3.1载体进行酶切,而后进行电泳,胶回收,用回收产物连接,转化感受态菌DH-5α,挑克隆测序。 结果 经测序证实成功构建pcDNA3.1+-Aβ3-10-CpG真核表达载体。 结论 成功构建pcDNA3.1+-Aβ3-10-CpG真核表达载体。可将其作为阿尔茨海默病的候选疫苗,为真核细胞表达及转基因动物体内试验提供了依据,也为进一步研究主动免疫清除老年斑的机理奠定了基础,为阿尔茨海默病基因疫苗的研制提供了新的手段。
【图文】：

真核细胞表达载体peDNA3.1书Ap3一10一CpG的构建经PCR及基因测序验经 NICBBLAST软件验证与目的片断无误。图1:PCR方法扩增合成目的基因的电泳结果，与 DNAMark对比DNA分子量与目的基因一致(M为DNAMark条带，O为合成目的基因条带)

MO图2，图3，，pOC57一Ap3一10·CpG阳性细菌克隆PeR产物的电泳结果M0 peDNA3.1书Ap3一10一CpG阳性细菌克隆PCR产物的电泳结果
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R749.16

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本文编号：2667515