抑郁症患者代谢组与肠道菌群结构特征分析及Bacopaside Ⅰ抗抑郁作用的机制研究

发布时间：2020-05-19 14:50

【摘要】：抑郁症是一种以情绪低落、兴趣缺乏、思维迟缓、无价值感和负罪感等主要临床特征的慢性精神障碍疾病,常伴有食欲不振、疲劳感增加、失眠、注意力不集中等症状。它具有高患病率、高死亡率、高复发率和高自杀率等特点。抑郁症的发病机制十分复杂。一般认为其与遗传、生物化学、内分泌、免疫、社会心理、文化等多种因素有关。目前,临床上对抑郁症的诊断主要依赖于医师通过使用量表对患者的症状表现进行诊断评估。然而,这种诊断方法受临床医师的经验及患者自身的主观因素等影响,导致不能对抑郁症进行准确有效地识别,并不能准确有效的诊断抑郁症。因此,我们通过代谢组学的方法寻找抑郁症相关的潜在生物标志物不仅有利于揭示其病理机制,还为抑郁症的早期诊断和预后提供重要的物质基础。此外,近年来研究发现肠道菌群与抑郁症的发生发展有着密切的联系,且肠道菌群影响宿主的代谢表型,参与了宿主的共代谢过程,这种共代谢关系对于维持宿主的生理健康有着重要意义。然而目前对抑郁症与肠道菌群关系的研究多建立在动物模型上。因此,我们研究了抑郁症患者肠道菌群的结构变化如何影响其代谢表型,从而揭示肠道菌群参与抑郁症整体代谢的病理生理机制。另一方面,临床上使用的抗抑郁药物具有一定程度的副作用、有效治愈率不高,且患者对药物存在明显的个体差异性,导致临床治疗效果不佳,故而寻找副作用小,治疗效果好的有效药物成为研究热点。因此,本课题首先基于超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q/TOF-MS)技术,采用代谢组学的研究方法对一批临床抑郁症患者的血清和尿液分别进行了研究,筛选和挖掘与抑郁症相关的潜在生物标志物;接着利用Illumina MiSeq高通量测序技术并结合多变量统计学方法对抑郁症患者粪便细菌16S rDNA基因的V3-V4区进行全面分析,探索抑郁症患者肠道菌群的整体结构多样性特征,并找出与疾病相关的细菌物种;并在此研究的基础上,研究肠道菌群的结构变化对抑郁症代谢表型可能产生的影响;然后通过本课题组的天然产物活性筛选平台得到了一个具有较好抗抑郁活性的皂苷类化合物Bacopaside Ⅰ,结合代谢组学和分子生物学等技术手段对其抗抑郁症的作用机制进行了深入探索。具体研究内容如下:1、基于UPLC-Q/TOF-MS技术对抑郁症患者和健康对照组的血清和尿液样本分别进行了代谢组学研究。研究结果显示,在正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)的多元统计得分图上显示抑郁症患者的血清与尿液样本均与健康对照组存在明显的分类趋势,结合单变量的统计分析方法分别筛选到了50个和75个与抑郁症相关的血清和尿液的差异代谢物。利用MetaboAnalyst软件通过对这些差异代谢物涉及的代谢通路进行富集分析,发现抑郁症患者血清的代谢物异常主要表现在甘油磷脂代谢、胆汁酸生物合成代谢、鞘脂代谢等途径;而尿液的差异代谢物主要涉及精氨酸和脯氨酸代谢、咖啡因代谢、D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢、嘌呤代谢、氨酰基-tRNA生物合成以及赖氨酸生物合成等代谢异常。此外,基于二元logistic回归模型筛选到12个AUC大于0.9的血清代谢物,进一步绘制了其中4个肉碱类代谢物作为生物标志物群构建的ROC曲线,其ROC曲线下面积为0.991,敏感度为96.5%,特异性为93%。同理,我们在尿液差异代谢物筛选到4个AUC大于0.8的代谢物,其作为生物标志物群构建的ROC曲线面积为0.897,敏感度为86%,特异性为84.2%。以上研究为进一步理解抑郁症的发病机制及日后临床的早期诊断与筛查提供了基础。2、接下来,采用Illumina MiSeq高通量测序方法对抑郁症患者和健康人群肠道菌群多样性结构特征进行了全面分析。尽管两类人群的粪便菌群存在明显的个体差异,但抑郁症病人肠道菌群的多样性和丰富度与对照人群无明显差异,其主要优势菌门均为厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门,且厚壁菌门/拟杆菌门的丰度比值在抑郁症患者中显著增加。Beta多样性分析发现抑郁症患者与健康人群的肠道菌群结构存在明显的差异,进一步研究表明这一肠道菌群结构失衡的主要特征是一些条件致病菌或潜在致病菌属的丰度显著增加,而对肠道有益的产丁酸盐菌和抗炎性菌属的丰度明显减少。这些菌群变化可能在抑郁症发生发展过程中起到一定的作用。本研究从肠道微生态的角度丰富了抑郁症的病因学理论,为今后以肠道菌群为靶点,优化肠道菌群结构,从而为预防和治疗抑郁症奠定了基础。3、在前面1-2部分研究的基础上,通过Pearson相关系数计算的方法对抑郁症血清和尿液筛选的差异代谢物与16S rDNA基因高通量测序得到的肠道菌群数据进行相关性分析,结果发现,抑郁症患者肠道内产SCFA的细菌菌属与涉及能量代谢、胆汁酸代谢、氨基酸类神经递质代谢的代谢物存在相关性,提示我们肠道菌群结构失调可能影响这些代谢途径,进而影响了宿主的代谢表型,这为我们进一步探讨肠道菌群参与抑郁症患者整体代谢的病理生理机制提供了参考。4、利用国际公认的慢性轻度不可预见性应激(CUMS)方法诱导的抑郁症小鼠模型评价Bacopaside Ⅰ的抗抑郁作用。研究结果显示,通过行为学实验发现Bacopaside Ⅰ能显著升高CUMS小鼠蔗糖溶液摄入量,明显减少CUMS小鼠在悬尾、强迫游泳中不动时间,但对小鼠无中枢兴奋性作用,这提示Bacopaside Ⅰ对CUMS小鼠抑郁行为具有良好的改善作用。ELISA、RT-qPCR和Western blot的实验结果揭示Bacopaside Ⅰ能显著降低CUMS小鼠血浆中皮质酮的含量,Bacopaside Ⅰ能提高CUMS小鼠海马和前额组织中GR和BDNF mRNA的表达量,上调海马和前额部位GR、BDNF、pERK和pCREB蛋白的表达。这提示Bacopaside Ⅰ可能是通过调节HPA轴的过度活跃以及激活海马和前额组织中的BDNF信号途径来产生抗抑郁作用的。其次,利用基于UPLC-Q/TOF-MS的技术对上述给予高剂量的Bacopaside Ⅰ的小鼠血浆样本进行代谢组学分析,进一步探讨Bacopaside Ⅰ对抑郁症小鼠整体代谢谱的影响及其相关的作用机制。研究结果显示,模型组小鼠与正常组、药物干预组与模型组小鼠的血浆谱均存在显著性差异,利用多变量和单变量的统计学方法,我们共鉴定了35个与CUMS模型以及药物干预相关的差异代谢物。其中,与模型组小鼠相比,Bacopaside Ⅰ调控了19个内源性代谢物,氟西汀调控了26个内源性代谢物,Bacopaside Ⅰ和氟西汀同时调控了15个内源性代谢物。进一步分析发现,CUMS诱导的抑郁小鼠在甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、α-亚麻酸代谢、亚油酸代谢、氨基酸代谢以及氧化应激等方面发生了失调,氟西汀和Bacopaside Ⅰ可能是通过调控这些紊乱的代谢途径从而产生抗抑郁效应的。综上所述,本课题利用基于UPLC-Q/TOF-MS技术筛选了与抑郁症患者血清和尿液相关的内源性差异代谢物,分析了与抑郁症致病机制相关的异常代谢通路,从整体层面揭示了与抑郁症相关的病理机制;接着利用Illumina MiSeq高通量测序技术研究了抑郁症患者肠道菌群的整体结构多样性特征,找出与疾病相关的细菌物种;并在此研究的基础上,研究了抑郁症患者肠道菌群的结构变化是如何影响其代谢表型的,从而揭示了肠道菌群参与抑郁症整体代谢的病理生理机制,对今后诊断和治疗抑郁症具有重要意义。另外,利用本课题组的天然药物活性筛选平台和基于分子生物学及代谢组学的方法对筛选到的天然产物Bacopaside Ⅰ的抗抑郁作用机制进行了探索,阐明了Bacopaside Ⅰ治疗抑郁症的相关作用途径和机制,这些结果为进一步寻找新颖有效的抗抑郁药物提供了新的思路。
【图文】：

流程图,代谢组学,网络流程

抑郁症患者代谢组与肠道菌群结构特征分析及 Bacopaside I 抗抑郁作用的机统生物学的一个分支，是继基因组学（genomics）、转录组学（transcript组学（proteomics）后新发展起来的一种组学技术，已在疾病诊断、药物全等研究领域展现出巨大的优势[56-58]。与基因组学和蛋白质组学不同的告诉我们生物体系已经发生了什么，最能客观反映生物体最终的代谢状学的重要补充[59]。（二）代谢组学的研究策略谢组学研究的基本研究方法主要包括以下几个方面：生物样本的选择和处理、代谢物检测分析、采集的数据预处理、多元统计分析、生物标志志物的生物学意义阐明。基本分析流程图如图 1-1。

肠道菌群,宿主,疾病,相互作用

图 1-2 宿主、环境及肠道菌群相互作用影响人体健康及疾病Figure 1-2 Effect of interactions among the host, environment and gut microbiotain human health and diseases（四）肠道菌群的检测方法为了研究肠道菌群的种类及其生物学功能，各国研究者利用各种方法对其成员组成和功能进行了大量的工作。传统的研究方法主要是通过选择性细菌培养技术对培养的微生物进行鉴定，该方法耗时、费力、繁琐。然而，由于肠道内大多数细菌特殊的生长环境，，很难选择合适的培养基和控制严格的厌氧条件，导致绝大多数微生物难以分离培养，这在很大程度上限制了我们对肠道菌群的认识。近年来，随着分子生物学技术的快速发展及其在肠道菌群中的应用，越来越多的研究者们采用不依赖于纯培养的方法来研究肠道菌群，从而大大扩展了对肠道菌群的鉴别能力，也更加客观、快速、全面地分析肠道菌群的结构组成。常用的微生物分子生态学分析技术可以分为两大类：①基于 DNA 指纹图谱技术，常用的主要包括变性梯度凝胶电泳技术、温度梯度凝胶电泳技术、时相温度梯度凝胶电泳技术、末端限制性片段长度多态性技术、肠杆
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R749.4

【参考文献】