大麻素Ⅱ型受体敲除对阿尔兹海默样小鼠学习记忆损伤的影响及其机制研究

发布时间：2020-05-19 21:40

【摘要】：目的:利用大麻素Ⅱ型受体敲除(CB2R KO)小鼠与阿尔兹海默病(AD)模型小鼠APP/PS1转基因小鼠构建APP/PS1/CB2R~(-/-)模型小鼠,基于此动物模型研究CB2R敲除后对AD模型小鼠学习记忆能力损伤进程的影响及可能的AD病理改变和参与学习记忆损伤的相关分子机制。方法:选取症状前期(4月龄)、发病早期(6月龄)、发病中晚期(10月龄)模型小鼠,利用新奇物体识别实验和Morris水迷宫实验分别评价模型小鼠非空间及空间学习记忆能力变化。通过实时定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction)方法检测模型小鼠各组皮层和海马脑区促炎因子白介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的mRNA表达水平的变化。利用ELISA法检测各组小鼠皮层和海马脑区可溶性β淀粉样蛋白1-40(Aβ_(1-40))及可溶性β淀粉样蛋白1-42(Aβ_(1-42))含量。利用蛋白质组学技术和Ingenuity IPA数据库对4月龄模型小鼠皮层脑区全蛋白质组进行代谢途径网络分析,通过差异分析,从系统生物学角度解释CB2R参与调控AD疾病学习记忆损伤的分子机制。利用Western Blot方法验证敲除CB2R影响AD疾病学习记忆损伤的主要信号分子通路变化。结果:1.新奇物体实验结果表明,与APP/PS1组相比,4月龄APP/PS1/CB2R~(-/-)组小鼠新奇识别指数(RI)值下降31.7%(P0.001);APP/PS1组与Ctrl组小鼠相比无明显差异(P0.05),与APP/PS1组相比,6月龄APP/PS1/CB2R~(-/-)组小鼠RI值下降下降24.5%(P0.05);与APP/PS1组相比,10月龄APP/PS1/CB2R~(-/-)组小鼠RI值无统计学差异(P0.05),而APP/PS1组较Ctrl组小鼠相比明显降低(P0.001)。提示在各月龄各组模型小鼠中,APP/PS1组鼠非空间学习记忆能力呈进行性下降,敲除CB2R对Ctrl组小鼠无影响,但是会导致APP/PS1组小鼠非空间认知功能损伤提前出现。2.Morris水迷宫实验结果显示,4月龄各组之间潜伏期与穿台次数均无统计学差异(P0.05),6月龄第5天APP/PS1/CB2R~(-/-)组较APP/PS1组相比潜伏期增长(P0.05),提示敲除CB2R对APP/PS1小鼠空间认知功能影响较小。3.RT-qPCR实验结果显示,在4月龄模型小鼠中,与CB2R~(-/-)组相比,APP/PS1/CB2R~(-/-)组皮层IL-6的mRNA表达水平明显增高(P0.05),而TNF-α与iNOS表达未见明显变化(P0.05);海马脑区各促炎因子均未见明显变化(P0.05);在6月龄模型小鼠中,与APP/PS1组相比,APP/PS1/CB2R~(-/-)组皮层IL-6的mRNA表达水平显著增高(P0.05),与APP/PS1组相比,APP/PS1/CB2R~(-/-)组皮层TNF-α的mRNA表达水平显著增高(P0.05),iNOS的mRNA表达水平未见明显变化(P0.05);与APP/PS1组相比,APP/PS1/CB2R~(-/-)组海马区IL-6的mRNA表达水平显著增高(P0.05),而TNF-α与iNOS的mRNA表达水平未见明显变化(P0.05)。提示APP/PS1小鼠皮层促炎因子释放水平随年龄增长而增高,敲除CB2R导致APP/PS1小鼠皮层促炎因子增高提前出现,表明神经源性炎症可能参与模型小鼠早期非空间学习记忆能力损伤。4.ELISA实验结果显示,4月龄APP/PS1/CB2R~(-/-)组皮层可溶Aβ_(1-42)含量较APP/PS1组增高了1.67倍(P0.05),海马脑区无统计学差异,皮层及海马区可溶性Aβ_(1-40)含量未见明显差异,提示敲除CB2R导致APP/PS1小鼠早期皮层可溶性Aβ_(1-42)含量增高。5.为了进一步探究CB2R敲除后AD模型小鼠早期即出现认知功能障碍的分子机制,我们采用高通量高敏感度质谱(线性轨道离子阱质谱,Orbitrap Q-Exactive,Thermo Scientific)的蛋白质组技术并应用Ingenuity IPA数据库对全蛋白质组进行代谢途径网络分析,深入探寻CB2R敲除后导致症状前期(4月龄)APP/PS1小鼠学习记忆障碍提前出现的的分子机制和调控模式。采用线性轨道离子阱色谱-质谱技术对4月龄各组小鼠皮层组织进行差异蛋白质分析,共分析1737种蛋白,Ctrl组与APP/PS1组间有26种差异蛋白,高表达12种,低表达14种,其中成功检测到APP蛋白的差异,表明蛋白质组学分析可靠。敲除CB2R后,CB2R~(-/-)组与Ctrl组间有54种差异蛋白,其中高表达40种,低表达14种。APP/PS1/CB2~(-/-)组与APP/PS1组间有114种差异蛋白,其中高表达85种,低表达29种。差异蛋白的生物信息学分析显示,APP/PS1组敲除CB2R受体后差异蛋白多参与到mTOR信号通路、p38 MAPK信号通路、GABA信号通路、NF-κB信号通路、RAN信号通路等多个信号通路改变,这些信号通路多与炎症调节、突触结构重塑、线粒体功能障碍、NMDA受体调节等功能相关。根据生物信息学分析结果发现,Syngr3、Hint1、Dnm1、Ipo5等核心蛋白可能作为AD发病机制的重要影响因素。6.Western Blot结果显示,记忆损伤出现前期(4月龄)敲除CB2R使模型小鼠PI-3K/AKT/mTOR信号通路及Erk1/2信号通路激活,而p38MAPK信号通路不受CB2R敲除影响。提示模型小鼠早期认知功能障碍与相关病理改变与PI-3K/AKT/mTOR信号通路及Erk1/2信号通路异常相关。结论:敲除CB2R引起AD模型小鼠症状前期(4月龄)与发病早期(6月龄)出现脑区相关的非空间学习记忆能力损伤。发病早期(6月龄)的AD模型小鼠认知功能障碍与脑内小胶质细胞介导的神经源性炎症密切相关。CB2R敲除可以导致症状前期(4月龄)AD转基因小鼠认知功能障碍提前出现,与皮层脑区神经毒性的Aβ_(1-42)寡聚肽过度表达,皮层脑区介导神经源性炎症的小胶质细胞的激活及PI-3K/AKT/mTOR信号通路和Erk1/2信号通路异常激活密切相关。此外,对于症状前期(4月龄)模型小鼠皮层脑区差异蛋白分析提示,突触蛋白表达和功能异常可能是参与CB2R敲除导致AD模型小鼠认知功能障碍提前发生的重要调节机制。
【图文】：

敲除CB2R后对各月龄Ctrl与APP/PS1小鼠的新奇识别指数的影响

大麻素Ⅱ型受体敲除对阿尔兹海默样小鼠学习记忆损伤的影响及其机制研究

敲除CB2R后对各月龄Ctrl与APP/PS1小鼠水迷宫的影响
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R749.16

【参考文献】