【摘要】：背景:以细胞内tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结和APP剪切而成的毒性Aβ聚集形成的细胞外淀粉样斑块为特征的阿尔兹海默症(AD)发病机制不清,究其原因主要为AD发病因素众多,并且进程中关键致病分子不明。本课题前期研究显示,在构建的AD患者全景式基因网络中发现DTL呈高水平状态并与AD病理表征密切相关,提示DTL及其编码的蛋白Cdt2在AD发病中可能发挥重要作用。DTL为细胞周期网络关键基因,其编码的蛋白Cdt2为一种E3-泛素化连接酶复合物的底物识别亚基,可促进P21等底物的泛素化降解。P21为细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK,cyclin-dependentkinase)抑制因子,可通过与CDK结合从而抑制该激酶的活性。已有研究表明,在CDK家族中,CDK1和CDK5与AD发病高度相关,均可作为tau蛋白上游激酶,通过促进tau过度磷酸化导致神经原纤维退变。CDK5诱发AD的研究报道更为广泛,其过度激活可导致神经元迁移、分化以及记忆巩固发生障碍,参与AD神经退行性病变。因此,本课题拟研究细胞周期关键基因DTL所编码的E3-泛素化连接酶Cdt2,探讨其是否在中枢神经系统通过促进泛素化降解其底物P21,解除对CDK家族如CDK1或CDK5等活性的抑制作用,过度活化的CDKs又通过促进其底物tau和APP等磷酸化,一方面导致tau过度磷酸化从而促进神经原纤维退变,另一方面APP过度磷酸化而更易被剪切成毒性Aβ并聚集形成淀粉样斑块。目的:探讨Cdt2通过调节CDK活性参与AD的两大特征性神经病理学变化,阐明细胞周期关键基因DTL与AD的密切关系,为AD发病机制提供新线索。方法:通过大规模整合不同临床痴呆程度AD病人和正常人死后尸检样本的海马旁回、额下回、颞上回和内嗅皮层四个脑区,进行RNA测序检测,获得基因表达数据(来源于美国西奈山医学院NIH神经生物样本库MS-NBTR和AlzData数据库),以分析DTL在AD人脑中的表达变化情况;在HEK293或HEK293/tau细胞中,瞬时转染空载或过表达Cdt2的质粒48h,免疫印迹法(Western Blot)检测P21的蛋白水平变化;应用特异性抗体分别将CDK(1-5)从细胞裂解液中分离出来,与底物Histone-1共孵育后,Western Blot检测Histone-1 Ser/Thr磷酸化水平,以确定CDKs活性变化;收集以上转染的细胞样本,提取RNA,通过link-RNA测序,原始测序结果通过STAR测序仪(version2.5.0b)与人类hg19基因组进行比对,基于数据库基因模型GRCh37.70,利用特征计数在基因水平进行基因表达的定量分析;在HEK293或HEK293/tau细胞中,瞬时转染过表达Cdt2 48h后再用CDK抑制剂Roscovitine(10μM)处理4h,通过Western Blot检测tau的磷酸化水平,ELISA检测可溶性Aβ42的水平,并通过Co-IP(蛋白质免疫共沉淀)检测CDK1和CDK5与APP的结合水平以及APP的磷酸化水平和APP与BACE1的结合水平,再通过link-RNA测序,进行基因表达的定量分析,以确定CDK在Cdt2介导的AD病理学机制中的作用;包装过表达Cdt2的腺相关病毒,脑立体定位注射于C57小鼠前额叶皮质区,感染一个月后,进行Roscovitine(1OmM)干预,通过旷场、新事物识别、水迷宫检测动物的情绪、运动、认知、学习记忆等行为学变化情况,通过电生理检测LTP,反映神经元突触可塑性,通过Western Blot检测tau的磷酸化水平,ELISA检测可溶性Aβ42的水平变化,高尔基染色分析神经元树突棘形态和数目的改变,以确定在动物脑内,Cdt2过表达以及CDK抑制剂的干预对动物AD样病变的影响。结果:1.综合海马旁回、额下回、颞上回和内嗅皮层四个脑区的数据(来源于美国西奈山医学院NIH神经生物样本库MS-NBTR和AlzData数据库),分析结果显示,DTL在AD人脑中的表达显著上调。2.在过表达Cdt2的细胞中:①Western Blot结果显示P21蛋白水平与对照组相比明显下调;②CDK(1-5)活性检测结果显示Histone-1磷酸化水平均有不同程度的升高,即Cdt2过表达可导致CDK1,CDK2,CDK3,CDK4和CDK5活性上调;③RNA测序结果显示,与对照组相比,过表达Cdt2组有2713个基因表达上调,2760个基因表达下调,在上调的差异表达基因中,CDK家族基因有三个,在下调的差异表达基因中,有一个CDK家族基因和一个CDK抑制因子基因,并且还包括APOE、CASS4、CELF1、CLU和SORL1在内的AD高风险基因发生了显著性差异表达。3.在HEK293/tau细胞和C57小鼠中,过表达Cdt2后:①Western Blot结果显示,tau Ser396位点的磷酸化水平明显上调;②ELISA结果显示,可溶性Aβ42的水平明显上调;③Co-IP结果显示,CDK1和CDK5与APP的结合水平、APP的磷酸化水平以及APP与BACE1的结合水平,在Cdt2过表组中均显著上调,而CDK抑制剂Ro sco vitine干预后,以上变化均有明显恢复。4.link-RNA测序结果显示,Roscovitine干预Cdt2过表达的细胞后,有超过5400个DTL过表达导致的差异表达基因的表达水平得到逆转。5.在C57小鼠中:①旷场、新事物识别、水迷宫检测结果显示,过表达Cdt2的小鼠的情绪和运动能力没有受到影响,认知功能明显减弱;②LTP结果显示,过表达Cdt2的小鼠神经元突触可塑性显著降低;③高尔基染色结果显示,过表达Cdt2的小鼠神经元树突棘形态发生退化,数目明显减少,Roscovitine干预后,以上认知以及神经损伤均有明显逆转。6.将DTL过表达后的差异表达基因与调控AD的关键细胞周期子网络进行比对发现二者有显著的重叠。结论:1.DTL在AD人脑中表达上调,提示DTL与AD发病高度相关;2.Cdt2可通过促进P21泛素化降解,导致CDKs活性上调;3.DTL过表达不仅可以影响诸多CDK家族蛋白的表达,还影响了APOE、CASS4、CELF1、CLU和SORL1等AD高风险基因的表达;4.Cdt2上调CDKs活性导致tau过度磷酸化和毒性Aβ增加;CDKs抑制剂可明显逆转Cdt2过表达导致的认知功能障碍和基因表达改变;DTL可通过细胞周期调控参与AD发病。AD脑内DTL/Cdt2过表达通过促进泛素化降解其底物P21,解除对CDK家族如CDK1或CDK5等活性的抑制作用,一方面激活的CDKs导致tau过度磷酸化、促进神经原纤维退变,另一方面活化的CDKs磷酸化APP、促进Aβ毒性,加重AD进程。背景:鉴于阿尔兹海默症(AD)发病机制和诱导因素多而复杂,多靶点定向配体(MTDLs)可能通过靶向多种发病机制、协同作用治疗AD。药用植物贯叶连翘提取物在AD动物模型中的有益作用已被不断报道,但贯叶连翘次生代谢产物中,特别是自其主要成分PPAPs(Polycyclic Polyprenylated AcylPhloroglucinols)衍生且具有新颖骨架的5种化合物(化合物1-5)是否也具有抗AD的生物活性及潜在的治疗功效不明。目的:以BACE1和PP2A活性调节为靶点,筛选并研究贯叶连翘次生代谢提取产物关键成分PPAPs的抗AD活性和药用价值。方法:分别在N2a/APP和HEK293/tau细胞中,通过CCK8试剂盒检测给药处理后细胞活力,以评估分离提取自贯叶连翘的PPAPs中具有新颖骨架的5种衍生化合物(化合物1-5)毒性和安全浓度范围;应用试剂盒检测BACE1和PP2A活性,分别计算化合物IC50和EC50,评估化合物调节BACE1和PP2A酶活的生物活性并进行筛选;通过蛋白质免疫印迹和ELISA检测tau蛋白磷酸化平和APP剪切以及毒性Aβ水平。在动物水平,采用经导管植入的脑立体定位注射于3 × Tg AD小鼠侧脑室,连续给予化合物一个月,通过旷场、新事物识别和Morris水迷宫检测小鼠的运动、学习记忆能力;用高尔基染色检测树突棘的数目;采用酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫印迹法(Western blot)检测化合物在动物体内对BACE1和PP2A活性及毒性Aβ生成和tau磷酸化水平的影响。结果:细胞活性检测结果显示,分别在N2a/APP和HEK293/tau细胞水平,化合物1-5,处理浓度达到8μM时均未表现出细胞毒性作用,提示其具有较高安全性;在N2a/APP细胞中,与LY2811376(一种BACE1抑制剂阳性对照药,IC50为260.2nM)相比,化合物2和3能够有效的抑制BACE1活性,IC50分别为136.2和98.62nM;在HEK293/tau细胞中,与SCR 1693(一种激活PP2A的阳性对照药,EC50为413.9 nM)相比,化合物2和3能够有效激活PP2A,EC50分别为258.8和199nM;在细胞水平,化合物2和3均能有效的降低tau蛋白磷酸化水平、APP的β剪切以及毒性Aβ42水平,而化合物3效果更加显著;并且,化合物3在减轻3 × Tg AD小鼠的病理和认知损伤方面具有显著的治疗作用。结论:作为一种具有多功能骨架的先导化合物,化合物3既可激活PP2A,同时也能抑制BACE1,呈现出较好的抗AD特性,有望为AD药物开发提供依据和支持。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R749.16
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5 $$点评人：陆佳韵（现为中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点试验室博士生） $$吴eㄖ泄窖Э蒲г褐琢鲅芯克赴锸抑魅危夜窖б糯У牡旎酥唬，
本文编号：2679564
