酰基氨肽酶的改造、实时调控及其治疗阿尔茨海默症的研究

发布时间：2020-05-29 03:05

【摘要】：随着近年来科技的发展,对于极端环境来源的微生物的研究得到广泛关注。其中在快速发展的酶学领域中,嗜热微生物来源的酶不仅在高温环境下具有良好的稳定性,而且具有令人惊奇的潜在催化能力,此类特性为探索新的生物催化剂的研发与应用提供了新选择。源自嗜热古菌的酰基氨肽酶具有较高的研究价值,已有报道其在合成应用中展现出良好的非专一性催化合成C-C键的能力,且在清除细胞毒性蛋白质中起着关键作用。有鉴于此,我们利用本实验室自主克隆表达的一系列酰基氨肽酶,进行了以下三方面研究:(1)考察酰基氨肽酶的改造对结构功能的影响并筛选性能优良的突变体,研究酶的结构特性,提高非专一性催化Aldol加成反应的产率及催化效率;(2)设计和构建近红外响应型嗜热酰基氨肽酶纳米材料复合体体系,探究该体系在实时调控催化Aldol加成反应中的应用;(3)探究嗜热酰基氨肽酶在阿尔茨海默症治疗方面的应用,提出酶与靶向单链抗体联用的治疗策略,最终构建靶向嗜热酰基氨肽酶纳米材料复合体,实现其在阿尔茨海默症治疗及预防方面的应用。首先我们选择了本实验室已经成功表达的具有不同最适催化温度的酰基氨肽酶(中温酰基氨肽酶BSU32230、嗜热酰基氨肽酶ST0779、超嗜热酰基氨肽酶APE1547)作为研究对象,通过同源比对及结构模拟结果分析,推测酰基氨肽酶的桥接结构元件对酶结构与功能所起的作用,但目前针对该类酶的结构元件的相关报道较少。桥接结构元件是连接两个结构域的枢纽结构,由两个结构元件组成,包括直接连接两个结构域的linker区和由N端伸向C端催化结构域的N-末端α螺旋。本文通过在linker区中插入或敲除氨基酸来改造该区域,重点研究桥接结构的linker区,结果显示linker区直接影响酶的稳定性和催化性能。说明桥接结构元件对酶催化性能影响较大,其对酶结构的稳定性也起着至关重要的作用。本文通过对桥接结构理性改造设计,成功筛选出具有良好稳定性、更佳催化能力的突变体ST-4A,提高了催化Aldol反应的产率,有利于化学合成领域的应用。另一方面,本文选择嗜热酰基氨肽酶APE1547及ST0779作为研究对象,来构建实时调控、高效率、高特异性、高反应可控性的低能耗催化系统。通过构建嗜热酰基氨肽酶偶联金纳米材料复合体,利用近红外光激发纳米金的光热效应,实现局部快速递能以激活酶转化至活性状态并加热反应体系,最终应用于非专一性催化Aldol反应。其中该体系实现酶实时调控催化,即通过近红外光照射作为反应的开关,快速开启和终止酶催化反应,实现反应实时可控。该体系能有效提高酶非专一性催化Aldol有机反应催化速率,催化速率提高8倍。构建的复合体具有较好的可重复利用性和高稳定性,本文成功构建了实时调控固定化酶的催化体系。此外,由于其在清除细胞毒性蛋白质中起着关键作用,酰基氨肽酶具有较高的生物医学研究价值,已有报道人源酰基氨肽酶可作为潜在的Aβ降解酶,有效清除体内毒性Aβ的能力,在治疗阿尔茨海默症中具有潜在应用价值。目前人源酰基氨肽酶纯化后稳定性低,后续应用研究难度较大,阻碍其进一步用于药物的研发。因此,基于酰基氨肽酶潜在的应用价值,有望通过该家族同功能属性的外源酰基氨肽酶进行深入研究及新药研发。在本研究中,我们尝试利用来自于本实验室的嗜热酰基氨肽酶ST0779,检测发现其能有效降解Aβ多肽,降低Aβ介导的相关毒性。基于此,进一步提出嗜热酰氨肽酶ST0779和单链抗体12B4联合给药治疗策略,发现能更好的降解Aβ单体、解聚毒性寡聚体并抑制Aβ介导的相关毒性,具有良好的治疗效果。最终构建了靶向酰氨基肽酶纳米材料复合体,并辅以近红外光实时调控以加强治疗效果,实现在阿尔茨海默症线虫模型中降解Aβ并抑制Aβ介导的相关毒性,延缓线虫瘫痪率,获得一定的治疗效果。此项工作对酰基氨肽酶进行了系统深入的研究,揭示了桥接结构元件与催化机理之间的关系,并筛选出稳定性、催化性能更佳的突变体,为酰基氨肽酶的突变改造开创了新的方向,展现出酰基氨肽酶催化有机合成反应的应用潜力;另一方面,构建纳近红外光照射实时调控催化体系,应用于催化Aldol反应,展现酰基氨肽酶在合成应用中的潜在价值。最后,探究嗜热酰基氨肽酶在降解Aβ中的作用,提出嗜热酰氨肽酶ST0779和单链抗体12B4联合给药治疗策略,发现能更好的作用于Aβ并抑制Aβ介导的相关毒性,对阿尔茨海默症的治疗效果良好。通过以上研究,成功构建了靶向酰氨基肽酶纳米材料复合体,辅以近红外光实时调控加强了治疗效果,实现在线虫模型中降解Aβ的应用,延缓线虫的瘫痪情况。为阿尔茨海默病多功能药物研发提供了新策略,揭示了嗜热酰基氨肽酶在阿尔茨海默症方面的应用价值,为嗜热古细菌作为新型药物的应用彰显出巨大潜能。
【图文】：

示意图,氨肽酶,单体结构,酰基

保守的组氨酸位于最后 β 片层尾端。酰基氨肽酶催化三联体通常由 S活性位点丝氨酸附近存在保守序列 G-X-S-X-G，，其催化三联体序列与一致。催化三联体是酶催化活性的核心，其利用碱性氨基酸与酸性氨丝氨酸进攻底物，促使底物与酶形成过渡态共价体，利于后续催化过解肽键的过程实质为加成反应和消除反应，关键的四面中间体的形成利进行[6-7]。氨肽酶家族推进器结构域也至关重要，其由七个 β 片层组成的具有过可阻止大分子蛋白进入催化中心结构。因此，酰基氨肽酶家族无法水链，通常只能水解 30-55 个氨基酸组成的短肽。这说明该推进器结构族的底物特异性。近年来，酶分子晶体结构也证实推进器结构域位于进器结构的内部空腔直径恰巧小于催化中心开口，有底物存在时，推改变而分开，这种现象说明该结构域是底物进入活性位点的通道，能长链肽的意外水解，保证其催化功能的正常发挥[9-11]。

示意图,氨肽酶,酰基,示意图

79[12-13]。根据 APE1547 的三维结构、结合蛋白模拟、突变改造和化学修饰人们能够更精准地阐明结构与催化功能之间的关系，优化催化性能及应用当前研究表明，嗜热酰基氨肽酶由二聚体组成，单体由 C 端催化结构域和组成，两个结构域间由桥梁结构 linker 直接连接。同时，N 端结构域的末端 C 端的催化结构域表面，该结构对酶也起到连接两个结构域的作用。究颇为深入，模拟结构及突变研究显示，其中 N 端推进器结构域的末端，影响酶的催化能力和稳定性。该 α1 螺旋的疏水氨基酸对催化口袋的长程进而影响酶的催化性能。目前对于其它酰基氨肽酶家族成员的深入研究较为针对更多该家族成员的探究意义较大，揭示该家族结构与功能关系的也至，嗜热酰基氨肽酶的应用逐渐得到研究者的关注。值得注意的是，酰基氨 C-C 键合成反应效果较为突出。本课题组曾报道 ST0779 在催化 C-C 加成催化性能，是目前催化 Aldol 反应速率最快的酶[12]（图 1.2）。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R749.16;Q814

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