人羊膜间充质干细胞移植治疗阿尔茨海默病转基因鼠的实验研究

发布时间：2020-06-11 08:31

【摘要】：背景与目的:阿尔茨海默病(AD)又称老年痴呆,其主要症状是记忆力进行性减退,并伴有不同程度的认知、语言和人格方面的异常。年龄是AD最主要的危险因素,70岁后每增加5岁,AD发生的危险性增加1倍,80岁后约50%的人有发生AD的危险。随着人类平均寿命的延长,世界人口日趋老龄化,老年期痴呆的发病率也随之增加。老年痴呆已成为继心脏病,肿瘤,中风后的人类第四大杀手。目前研究者已经制作出各种阿尔茨海默病动物模型,希望能够找到治疗阿尔茨海默病的有效方法。其中主要有自然衰老动物模型、Aβ注射动物模型、缺氧所致动物模型、慢性缺血动物模型、胆碱能损害动物模型、铝中毒动物模型等,但是这些动物模型只是部分的模拟了阿尔茨海默病的病理变化或者是阿尔茨海默病的症状,而且这些动物模型价格昂贵,难饲养易死亡,使其在阿尔茨海默病的研究应用中受到了很大的限制。转基因动物模型的最明显的优点是模拟了AD样神经病理学特征,包括细胞外Aβ的沉积,营养不良性神经炎成分,神经胶质增生。转基因小鼠可能提供一个分析Aβ沉积机制和验证AD的治疗效果的较好的动物模型。目前老年痴呆的治疗主要包括胆碱能药物、脑细胞代谢激活剂、脑血循环促进剂、钙离子拮抗剂、神经营养因子以及抗氧化剂等,但疗效均不佳。Zhang等将人胚胎干细胞培养成具有神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞分化潜能的神经干细胞,在移植入新生鼠大脑后,发现这些神经干细胞能整合入受体鼠脑,并能分化为3种神经细胞;有文献将人神经干细胞移植到出生后24个月的大鼠侧脑室,4周后这些细胞有序地迁移到大脑皮质和海马,并分化为神经细胞和星形胶质细胞,部分细胞可和宿主细胞建立突触联系,并能显著改善衰老大鼠的认知功能。目前,神经干细胞移植已广泛应用于各种神经系统退行性病变的实验研究,应用体外培养的神经干细胞与脑源性神经营养因子联合治疗阿尔茨海默病大鼠,结果发现可促进大鼠学习记忆能力的恢复。骨髓基质细胞移植治疗血管性痴呆也取得了一定的效果。人羊膜间充质干细胞免疫原性较小,可能比较适合于异体移植治疗神经系统疾病的研究,但涉及人羊膜间充质干细胞用于老年痴呆的国内外报道少见。本实验旨在探讨人羊膜间充质干细胞对阿尔茨海默病的治疗作用。方法:①人羊膜间充质干细胞的提取、纯化、培养:无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的羊膜,PBS充分冲洗后剪成碎片,用0.25%的胰蛋白酶室温消化1h,弃去胰蛋白酶,然后用含1.0g/L的胶原酶Ⅳ的DMEM/F12培养液37℃消化2h,制成单细胞悬液,台盘兰染色,计数活细胞,以2×10~5个/ml接种于75ml培养瓶内。培养基采用V_(DMEM):V_(F12)=1:1的DMEM/F12加10%的胎牛血清(FBS)、bFGF(终浓度为20ng/ml),将细胞培养瓶置于37℃、饱和湿度、体积分数为5%的CO_2培养箱中培养48-72h后,更换培养液,弃去未贴壁的细胞,根掘细胞生长情况,每3-4天全量换液一次。待细胞达到80%-90%融合时,用0.25%的胰酶消化,然后按1:3的比例进行传代接种培养,并记为P1代。传代培养过程中每3d全量换液,直至贴壁细胞彼此融合,铺满瓶底,再重复上述操作,传代培养记为P2代,其余类推。 ②人羊膜间充质干细胞的鉴定:将人羊膜间充质干细胞培养至第三代,行Nestine免疫细胞化学染色。 ③流式细胞仪分析细胞表面标记:将人羊膜间充质干细胞培养至第三代,流式细胞仪分析细胞表面标记CD40、CD80、CD86。 ④实验动物分组:将经过PCR技术鉴定过的小鼠分为3组,分别为移植组、对照组、正常组,移植组为10只APP~+小鼠,雌雄各半,给予尾静脉移植人羊膜间充质干细胞治疗;对照组为10只APP~+小鼠,雌雄各半,给予尾静脉注射生理盐水;正常组为9只APP~-小鼠雌5雄4,未给予任何干预措施。 ⑤人羊膜间充质干细胞的体外标记:待人羊膜间充质干细胞培养至第三代时,移植前,Brdu以3μg/ml终浓度加入hAMSCs细胞培养瓶37℃、5%CO_2饱和湿度孵育箱中孵育24小时。移植时生理盐水洗涤3次,1ml 0.25%胰蛋白酶消化细胞30-60s,短时低速离心3次(1000prm,5min),去除悬液中的细胞碎片,用生理盐水重新悬浮细胞,调整细胞浓度1×10~6/ml备用。 ⑥人羊膜间充质干细胞的尾静脉移植:在第一轮morris水迷宫评价小鼠行为学情况之后进行,将第三代标记后的人羊膜间充质干细胞制成浓度为1×10~6个/ml的单细胞悬液,用容量为1ml的注射器将体积为0.5ml的细胞悬液经小鼠尾静脉注入移植组小鼠体内,注射时间大于一分钟,注射完成后留针10秒左右拔针。对照组小鼠给予注射同体积的生理盐水,正常组小鼠不给予干预措施。 ⑦小鼠空间学习能力的测定(morris水迷宫) 定位航行试验:试验开始前将动物放入水池中(不含平台),任其自由游泳两分钟,以熟悉适应迷宫环境。试验共进行两轮,细胞移植前和移植15天后各进行一轮,每轮试验共历时8天,每两天训练1遍,共4遍,每只动物每遍训练4次,分别从四个象限池边中点面壁放入,4个放入点随机顺序。记录大鼠从入水到找到并爬上平台的时间即逃逸潜伏期。若小鼠鼠在120秒内未找到平台则由实验者将其引向平台,潜伏期记为最高120秒。小鼠找到平台后让其在平台上休息30秒后进行下一次试验。每只小鼠每训练一遍4次的算术平均数即为此小鼠训练一遍的逃逸潜伏期。空间探索试验:于第9天撤除平台,随机选取两点先后两次面壁将小鼠投入水池中,分别摄像记录小鼠两次2min内水中游泳路径,用电脑分析计算小鼠两次在平台象限内游泳的时间的平均值及穿过原平台相应位置的次数的平均值。 ⑧鼠脑切片染色观察各组小鼠脑内β-淀粉蛋白的表达:分别于第一轮水迷宫测试前随机取模型鼠和正常鼠及细胞移植后一个月每实验组随机取小鼠处死,取脑组织冠状连续切片行甲醇刚果红染色观察三组小鼠脑内β-淀粉蛋白的表达情况。 ⑨鼠脑切片染色观察移植组小鼠脑内Brdu表达:细胞移植后一个月后将移植组小鼠处死,取脑组织蜡块包埋,冠状连续切片免疫组织化学染色观察小鼠脑内Brdu的表达。 ⑩鼠脑切片染色观察各组小鼠脑内GFAP、CHAT的表达:细胞移植后一个月将各实验组小鼠处死,取脑组织冠状连续切片行免疫组织化学染色观察三组小鼠脑内GFAP、CHAT的表达情况。结果:①经酶消化从羊膜分离的细胞于24 h内贴壁,72 h细胞呈圆形、梭形、星形和多角形等多种形态,培养至6-7d,细胞达80%～90%融合,呈放射状或漩涡状分布;传代后细胞3-4d铺满瓶底,传至3代,细胞形态很均匀,长梭形,有伪足。 ②免疫细胞化学染色观察可见人羊膜间充质干细胞Nestine表达阳性,胞浆着棕褐色,胞核被染成蓝色。 ③流式细胞仪分析细胞表面标记:人羊膜间充质干细胞表面较低表达CD40、CD80、CD86。 ④在定位航行试验中,移植前移植组与对照组之间无显著差异(P＞0.05),移植组与正常组之间差异显著(P＜0.05);移植后移植组与对照组之间差异显著(P＜0.05),移植组与正常组之间无显著差异(P＞0.05)。探索实验中,移植前后3组小鼠之间均无明显差别(P＞0.05)。 ⑤鼠脑冠状切片甲醇刚果红染色可见细胞移植前,模型鼠脑内可见较多斑片样β-淀粉样蛋白的沉积,被染成淡粉色,而正常鼠脑内则几乎看不到β-淀粉样蛋白的沉积;细胞移植后一个月,移植组小鼠脑内白质仍可见较多斑片样β-淀粉蛋白的沉积,被染成淡粉色,但数量较对照组已明显减少,单个β-淀粉蛋白团块面积也较对照组明显减小,正常组小鼠脑内几乎未见β-淀粉蛋白的沉积。 ⑥鼠脑冠状切片Brdu免疫组织化学染色可见移植组小鼠脑内Brdu阳性细胞存在,细胞核染成棕黄色,胞浆呈淡蓝色,阳性细胞聚集成团块状,分布未见有规律性。 ⑦移植后一个月,移植组小鼠脑内GFAP、CHAT的表达与正常组差别有统计学意义(P＜0.05);与对照组比较差别亦有统计学意义(P＜0.05)。结论:①用胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ能够从羊膜分离MSCs,人羊膜MSCs可在含10%FBS和20μg/L bFGF的DMEM/F12培养基中进行体外扩增。 ②Brdu体外标记的人羊膜间充质干细胞经尾静脉移植给阿尔茨海默病转基因小鼠体内后可以存活,并能迁移至转基因小鼠脑内发挥作用。 ③人羊膜间充质干细胞移植可以减少阿尔茨海默病转基因小鼠脑内β-淀粉样蛋白的沉积。 ④人羊膜间充质干细胞移植治疗可以改善阿尔茨海默病转基因小鼠的空间学习记忆能力。 ⑤GFAP、CHAT的表达的变化可能是人羊膜间充质干细胞移植治疗阿尔茨海默病转基因小鼠有效的表现形式。
【图文】：

对照组

图19正常组小鼠脑组织内CHAT的表达。(x200)图20对照组小鼠脑组织内CHAT的表达。(x200)图21移植组小鼠脑组织内CHAT的表达。(x200)

对照组

图19正常组小鼠脑组织内CHAT的表达。(x200)图20对照组小鼠脑组织内CHAT的表达。(x200)图21移植组小鼠脑组织内CHAT的表达。(x200)
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R749.161

【参考文献】