【摘要】：目的： 应用大脑中动脉栓塞法制备脑卒中大鼠模型,将成模后的大鼠随机分为实验组与对照组。实验组应用慢性不可预见的温和性刺激联合孤养制备卒中后抑郁大鼠模型。成模后将两组大鼠处死取额叶及海马组织,应用高效液相色谱法测定各组大鼠额叶及海马五羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)及多巴胺(DA)的含量；蛋白免疫印迹法测定各组大鼠额叶、海马中FGF-2蛋白的表达水平；实时定量PCR检测两组大鼠额叶中FGF-2的mRNA表达,来研究卒中后抑郁大鼠脑内五羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)及成纤维细胞生长因子(FGF-2)的含量的变化规律,探讨其与卒中后抑郁的关系。 方法： 1.采用改良的Koizumi线栓法(MCAO)对大鼠中动脉阻塞制备脑卒中大鼠模型。模型成功的判断标准：神经功能评分：按Zea Longa等[2]神经功能5分制评分。手提大鼠离开地面约1尺,观察两前肢的状况；将大鼠置于水平地面,推动其双肩,观察双侧抵抗力有无差异；大鼠置于地面,观察其行走情况。采用五级评分法(0-4分),分数越高,说明其神经行为损伤越严重。 (1)行为完全正常者,记0分； (2)提起大鼠尾巴离开地面,手术对侧前肢内旋、内收者,记1分 (3)将大鼠置于地面,用手挤压两侧检查其抵抗力,手术对侧抵抗力下降者,记2分； (4)将大鼠置于地面,观察其行走,围绕手术对侧转圈者,记3分； (5)损伤及其严重,已经无法自主活动者,记4分。 术后评1-3分者为手术成功的标志。0分、4分均视为模型制作失败。将成模后的大鼠随机分为对照组和实验组。2.实验组从术后第7天开始为期21d,按Willner方法[3]改进的慢性不可预见的温和性应激(chronic unpredictable mild stress, CMS)。CMS包括：①禁食禁水20小时；②禁水17小时；③倾斜鼠笼(45°)17小时；④持续光照17小时；⑤湿笼(100克锯屑+200毫升水)21小时；⑥4℃游泳5分钟；⑦水平摇晃5分钟；⑧行为限制2小时；⑨夹尾1分钟。结合孤养,9种刺激每日随机采取1种,共21天制备卒中后抑郁大鼠模型。于大鼠卒中造模成功后(术后21d)行敞箱实验。大鼠穿越底面块数为水平活动得分,一般情况大鼠靠边行走,穿越1格为1次,如果大鼠按直径方向行走,每行走l0cm为1次。大鼠直立次数为垂直活动得分,大鼠双足离开底面为垂直活动,大鼠站立无论多长时间直至双足放下为1次活动。进行下一只大鼠测定之前彻底清洁敞箱,每次测定时间为5min。 3.应用高效液相法检测各组大鼠额叶及海马中五羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)及多巴胺(DA)的含量。4.采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组大鼠额叶、海马中FGF-2蛋白的表达水平。大鼠额叶及海马经蛋白质抽提试剂(1mL抽提试剂中加入5μL蛋白酶抑制剂混合液),5μL苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)和5μL磷酸酶混合液提取蛋白质,考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。蛋白变性后取50μg进行20%十二烷基硫磺胺-聚丙烯酰胺电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE),结束凝胶电泳之后,通过转移电泳方式将凝胶上分离到的蛋白条带转印到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF),然后分别用非标记一抗(rabbit anti-fibroblast growth factor-2)及辣根过氧化物酶标记的二抗(山羊抗兔抗体)进行孵育、检测。增强化学发光法(enhanced chemiluminescence, ECL)显影,X光片暗室中感光,采用美国UVP分析仪器,对胶片进行扫描,然后括住每一个条带,系统自动生成灰度值,即为结果。 5.采用实时定量PCR(RealTimePCR)检测各组大鼠额叶中FGF-2的mRNA表达。将大鼠额叶组织破碎后,用Triziol法提取总RNA,然后用逆转录酶将mRNA逆转录为cDNA。构建聚合酶体系,见表1。Taq酶(Promega)催化。热循环：95℃预热5min,94℃20s,退火20s,72℃30s,40个循环。各样品目的基因和管家基因分别进行SYBR荧光实时定量RT-PCR反应,检测FGF-2 mRNA表达水平,结果为梯度稀释DNA标准曲线得到样品目的基因校正后的相对含量(目的基因与内参比值)(x±s),并分别计算实验组相对于对照组的含量。 结果： 1.本研究对60只大鼠应用线栓法制备脑卒中,45只大鼠制模成功,成模率为75.0%。 2.对23只大鼠应用CMS联合孤养制备卒中后抑郁大鼠,20只大鼠造模成功,成模率为86.9%。 3.实验组大鼠脑中额叶及海马5-HT、NE及DA的含量显著低于对照组(P0.01) 4. Western blot研究发现实验组大鼠的额叶FGF-2的蛋白表达水平显著低于对照组(P0.01),海马组织中FGF-2蛋白表达差异不显著(P0.05)。 5.实时定量PCR研究发现实验组大鼠的额叶的FGF-2的mRNA表达显著低于对照组(P0.01)。 结论： 1.卒中后抑郁大鼠脑中额叶及海马的单胺类递质的水平下降与卒中后抑郁的发病有一定的联系。 2.卒中后抑郁大鼠额叶FGF-2蛋白的表达水平下降是引起卒中后抑郁的原因之一 3.卒中后抑郁fgf-2 mRNA表达下调是引起脑内FGF-2蛋白表达水平下降的原因。 4.额叶在卒中后抑郁的发病中起主要作用。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R749.1
【参考文献】
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2709216
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