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海马CA1区βCaMKⅡ通过COX2-PGE2信号途径调控大鼠神经炎症及抑郁症状的发生

发布时间:2020-06-14 07:49
【摘要】:研究目的:抑郁症是一种以持续的心境低落为主要特征的神经障碍型疾病,是严重危害人类健康的神经、精神类疾病之一。抑郁症的发病受心理、遗传、生物学、社会等多重因素的影响。最近研究发现机体受到持续的应激刺激而诱发抑郁行为表现时,通常伴随特定脑区内神经炎症的发生,但神经炎症反应在抑郁症发病中的机制,目前尚不明确。因此,本课题拟构建慢性不可预知性温和应激刺激(Chronic Unpredicted Mild Stress,CUMS)诱导的抑郁症大鼠模型,采用行为学、分子生物学和形态学等多种实验方法,研究海马CA1区ββCaMKII是否通过调控COX2-PGE2信号通路参与神经炎症反应,并探讨其在抑郁症发病中的作用和机制。研究方法:(1)将雄性Wistar大鼠(140g-160g)随机分为空白对照组、CUMS组、COX-2抑制剂塞来昔布预处理组(Celecoxib+CUMS,20mg/kg)、抗抑郁药氟西汀预处理组(Fluoxetine+CUMS,40mg/kg)。除空白对照组外,其余三组均给予为期5周的慢性不可预知性温和应激刺激。每次在刺激前30分钟给予药物预处理组大鼠分别腹腔注射Celecoxib或Fluoxetine。建模完成后进行强迫游泳实验和糖水偏好实验等行为学测试。(2)Western Blot技术检测COX-2、ββCaMKII的表达及βCaMKⅡ蛋白的磷酸化水平;ELISA技术检测PGE2的含量变化;激光共聚焦检测小胶质细胞和星型胶质细胞的数量及形态变化。(3)Western Blot技术检测Nrf-2、HO-1的表达;利用试剂盒检测SOD、CAT、T-AOC酶活性,使用MDA、NO试剂盒检测产物含量变化,LDH试剂盒测定酶含量变化;激光共聚焦观察DHE、4-HNE和8-OHdG的表达,以检测ROS水平和DNA氧化损伤的变化。(4)构建过表达或敲减βCaMKⅡ的AAV腺相关病毒,靶向海马CA1区进行立体定位注射,将大鼠分成以下几组:(a)Wild type(WT);(b)CUMS;(c)CUMS+AAV-Control;(d)CUMS+AAV-βCaMKⅡ RNAi;(e)WT+AAV-control;(f)WT+AAV-ββCaMKII。病毒感染2周后进行强迫游泳实验和糖水偏好实验等行为学测试;Western Blot技术检测p38、p-p38、p-CREB、p-ATF2、COX-2等和关蛋白的表达;qPCR技术检测COX-2的mRNA水平的表达;ELISA技术检测PGE2的含量变化。(5)将Wistar雄性大鼠随机分为:(a)空白对照组;(b)CUMS组;(c)p38 阻断剂(SB203580)预处理组(SB203580+CUMS,1Oug/kg);(d)溶剂对照组(DMSO+CUMS,1%)。每次应激刺激前30分钟给予大鼠侧脑室注射SB203580或者1%DMSO,5周后进行强迫游泳实验和糖水偏好实验等行为学测试。采用Western Blot、qPCR等技术检测相关指标的变化。研究结果:(1)行为学测试结果显示:与空白对照组相比,CUMS组大鼠在强迫游泳实验中静止不动的时间显著延长(P0.05),在糖水偏好实验中糖水消耗百分比明显减少(P0.05),提示大鼠产生行为绝望和快感缺失等抑郁样行为。(2)与空白对照组相比,CUMS组大鼠海马CA1区COX-2表达增加,βCaMKII磷酸化水平升高,PGE2含量增高;激光共聚焦结果显示小胶质细胞和星形胶质细胞数量增多,呈激活状态,且IL-1 β、TNF-α、IFN-γ等炎症因子表达增加;而Celecoxib可有效抑制神经炎症的发生,并显著改善大鼠的抑郁样行为。(3)与空白对照组相比,Western Blot结果显示:CUMS组Nrf-2、HO-1表达量减少,SOD、CAT、T-AOC酶活性降低,同时,MDA和NO生成增加、LDH酶含量升高;激光共聚焦检测结果显示DHE、4-HNE高表达,ROS水平显著增加,8-OHdG标记细胞核内DNA损伤程度增加,提示抑郁样大鼠海马CA1区氧化应激反应增强。(4)在正常对照大鼠海马CA1区注射AAV-βCaMKⅡ过表达序列后,Western Blot结果显示:与空白对照组相比,过表达βCaMKⅡ后,p38、p-p38、p-CREB、p-ATF2、COX-2表达量均升高。(5)在抑郁症大鼠海马CA1区注射AAV-βCaMKⅡ-RNAi后,与CUMS组相比,p-P38、p-CREB、p-ATF2、COX-2等相关蛋白表达量均降低。(6)与CUMS组相比,给予大鼠SB203580预处理,可显著降低p-CREB、p-ATF2、COX-2等相关蛋白的表达,并明显抑制大鼠抑郁样行为的发生。结论:(1)CUMS能够有效诱导大鼠抑郁样行为的发生,并伴随着大鼠海马CA1区βCaMKⅡ的表达量升高。(2)βCaMKⅡ通过调控p38-COX2-PGE2信号通路介导慢性应激刺激导致的神经炎症和氧化应激反应,从而介导抑郁症状的发生。 【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R749.4

【图文】:

流程图,模型建立,流程图


图1.慢性不可预知性温和刺激(CUMS)模型建立流程图

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本文编号:2712479


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