下调PTEN对血管性痴呆大鼠学习记忆的影响及其机制的研究
发布时间：2020-06-15 22:38
【摘要】： 目的:血管性痴呆(Vascular dementia,VD)是由脑血管疾病引起的脑功能障碍而产生的获得性智能损害综合症,以记忆、认知功能缺损为主,所以有效改善患者的学习记忆功能是血管性痴呆研究的重点和突破点所在。第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)是具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因,研究发现下调PTEN表达对神经元有保护作用,且作为PI3K/Akt信号通路的关键负性调节因子,PTEN在神经元分化、树突分枝及突触可塑性方面也可发挥重要作用。因此,预测将其下调有可能参与改善VD大鼠的学习记忆能力。本课题利用PTEN特异性RNAi(RNA interference,RNA干扰)的重组腺病毒载体,转染血管性痴呆大鼠模型,选择与学习记忆相关的转录因子环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMP response element-binding protein,CREB)为切入点,观察PTEN基因沉默对痴呆海马区的病理改变、CREB表达变化以及学习记忆能力的改善,阐明PTEN在血管性痴呆突触可塑性及学习记忆中的重要作用,以期为临床血管性痴呆的基因治疗奠定基础。 方法: 1.应用人胚肾293细胞扩增PTEN特异性RNAi的重组腺病毒AdR-siPTEN,采用赛多利斯腺病毒纯化试剂盒纯化病毒并测定其滴度; 2.分别用适当剂量的重组腺病毒和空病毒(阴性对照)转染缺血痴呆大鼠海马组织,荧光显微镜观察红色荧光蛋白的表达,RT-PCR及Western blotting检测腺病毒转染后PTEN基因表达下降情况,探明RNAi对PTEN的抑制效率; 3. 40只SD大鼠随机分为缺血痴呆组(VD组),假手术组和腺病毒处理组(siPTEN组),阴性对照组(AdRFP组)。4周后分别应用水迷宫、HE和Nissl染色检测各组大鼠行为学及组织病理形态学变化,观察下调PTEN对痴呆大鼠学习记忆功能的影响; 4.应用RT-PCR及免疫组化分别从mRNA和蛋白水平检测PTEN表达下调后海马区Akt、CREB表达的变化,探讨下调PTEN对血管性痴呆大鼠海马神经元CREB表达的影响,从而探讨PTEN基因改善缺血痴呆大鼠学习记忆功能的分子机制。 结果: 1.重组腺病毒转染293细胞后,荧光显微镜下可观察到明确的红色荧光,扩增并纯化后AdR-siPTEN的滴度为:3.36×1010 pfu/ml;AdRFP的滴度为:2.98×1010pfu/ml。 2.转染腺病毒一定时限后,大鼠海马组织均出现红色荧光蛋白阳性表达; RT-PCR和Western blot结果显示:与假手术组相比,缺血痴呆后,PTEN mRNA和蛋白水平明显增高(p0.01),腺病毒干预后PTEN mRNA和蛋白表达水平下调(p0.01),而阴性对照组中PTEN表达无明显变化(p0.05); 3.水迷宫检测发现缺血痴呆后大鼠逃避潜伏期明显延长,跨越平台次数显著减少,经siPTEN处理后延长的逃避潜伏期缩短,减少的跨越平台次数增多(P 0.01 );与AdRFP组比较,siPTEN组逃避潜伏期也明显缩短,跨平台次数显著增多(P 0.01 );Nissl染色显示,siPTEN组海马神经元损伤程度明显轻于VD和AdRFP组大鼠;HE染色后光镜下观察,siPTEN组海马变性程度较VD和AdRFP组明显减轻,其结果与Nissl染色结果相吻合; 4. RT-PCR及免疫组化分别检测CREB mRNA基因表达和蛋白水平结果均显示:siPTEN组海马部位CREB水平较AdRFP组明显升高,但未至正常水平(p㩳0.01),表明siPTEN组大鼠空间学习记忆障碍得到改善可能与海马区CREB表达升高有关。 结论: 1.采用293细胞成功扩增了大量重组腺病毒AdR-siPTEN以满足后续实验的需要。 2.腺病毒能高效感染海马组织,有效进行PTEN特异性siRNA基因转导;腺病毒介导RNAi可有效、稳定地抑制海马组织中PTEN的表达。 3.缺血性痴呆后,大鼠出现空间学习记忆障碍,腺病毒介导RNAi沉默PTEN基因可明显减轻缺血痴呆海马神经元损伤及海马变性,提高CREB表达水平,从而明显改善VD大鼠的学习记忆能力。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R749.13
【图文】：
图 1 光学显微镜下 293 细胞形态（×100）Fig1 293 cells were visualized by bright microscopry（×100）图 2 光学显微镜下 293 细胞形态（×200）Fig2 293 cells were visualized by bright microscopry（×200）图 3 腺病毒转染293细胞24h后,荧光显微镜下观察RFP的表达（×100）Fig3 Adenovirus was transfected into 293 cells and RFPexpression was visualized by fluorescence aftertransfection 24h （×100）图4 腺病毒转染293细胞72h后，荧光显微镜下观察RF的表达（×100）Fig4 Adenovirus was transfected into 293 cells and RFPexpression was visualized by fluorescence aftertransfection 72h（×100）
图 1 光学显微镜下 293 细胞形态（×100）Fig1 293 cells were visualized by bright microscopry（×100）图 2 光学显微镜下 293 细胞形态（×200）Fig2 293 cells were visualized by bright microscopry（×200）图 3 腺病毒转染293细胞24h后,荧光显微镜下观察RFP的表达（×100）Fig3 Adenovirus was transfected into 293 cells and RFPexpression was visualized by fluorescence aftertransfection 24h （×100）图4 腺病毒转染293细胞72h后，荧光显微镜下观察RF的表达（×100）Fig4 Adenovirus was transfected into 293 cells and RFPexpression was visualized by fluorescence aftertransfection 72h（×100）
本文编号：2715103
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R749.13
【图文】：
图 1 光学显微镜下 293 细胞形态（×100）Fig1 293 cells were visualized by bright microscopry（×100）图 2 光学显微镜下 293 细胞形态（×200）Fig2 293 cells were visualized by bright microscopry（×200）图 3 腺病毒转染293细胞24h后,荧光显微镜下观察RFP的表达（×100）Fig3 Adenovirus was transfected into 293 cells and RFPexpression was visualized by fluorescence aftertransfection 24h （×100）图4 腺病毒转染293细胞72h后，荧光显微镜下观察RF的表达（×100）Fig4 Adenovirus was transfected into 293 cells and RFPexpression was visualized by fluorescence aftertransfection 72h（×100）
图 1 光学显微镜下 293 细胞形态（×100）Fig1 293 cells were visualized by bright microscopry（×100）图 2 光学显微镜下 293 细胞形态（×200）Fig2 293 cells were visualized by bright microscopry（×200）图 3 腺病毒转染293细胞24h后,荧光显微镜下观察RFP的表达（×100）Fig3 Adenovirus was transfected into 293 cells and RFPexpression was visualized by fluorescence aftertransfection 24h （×100）图4 腺病毒转染293细胞72h后，荧光显微镜下观察RF的表达（×100）Fig4 Adenovirus was transfected into 293 cells and RFPexpression was visualized by fluorescence aftertransfection 72h（×100）
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 李文联,王玲,张红爱;Ca~(2+)对新生大鼠脑缺氧缺血后CREB磷酸化及神经元凋亡的影响[J];第四军医大学学报;2004年03期
2 江刚,舒斯云,包新民;中枢学习记忆功能与环磷酸腺苷反应单元结合蛋白的关系[J];中国临床康复;2004年01期
本文编号：2715103
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