孕酮对AD细胞模型及动物模型神经再生的影响及机制研究

发布时间：2020-06-20 00:33

【摘要】：中枢神经系统的发育和再生一直是神经科学界备受关注的研究领域,传统观念认为成年哺乳类动物脑组织的神经元是终级细胞,一旦遭受破坏将不能再生。然而,近年来发现哺乳类动物脑内海马齿状回(dentate gyrus,DG)和侧脑室室管膜下区(subventricular zone,SVZ)的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)能够分化为神经细胞—神经发生(neurogenesis)。因此,新生神经元被认为能取代自然老化或者病变的神经元,最大限度地维护脑的功能和结构。阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种以进行性认知功能障碍为主要特征的中枢神经系统退行性疾病。AD的主要病理特征为:细胞外老年斑过度沉积,细胞内形成神经纤维缠结及神经元变性、缺失等。新生神经元是否能替代病变的神经元—神经再生(neuroregeneration),改善认知功能障碍已成为目前AD研究的一个新焦点。神经再生过程主要包括神经干细胞增殖,分化和成熟等。在AD脑和APP/PS1转基因小鼠中,海马神经元前体细胞向神经元分化比例明显减少,新生神经元的存活率与Aβ产生和沉积的严重程度呈负相关,同时新生神经元的突起生长异常,提示神经再生障碍是导致AD认知功能进行性减退的重要病理机制之一。细胞周期阻滞及增殖相关信号通路的改变是细胞增殖抑制的两个主要机制。Aβ聚集使其具有神经细胞毒性,破坏细胞膜完整性引起细胞内DNA断裂,导致细胞周期异常。在AD患者海马组织cAMP水平下降,环磷酸腺苷反应序列结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)磷酸化水平下降,证实了CREB与AD的形成有密切关系。神经甾体是中枢神经系统中各种甾体及其代谢产物的总称。孕酮(progesterone,PROG)是一种重要的内源性神经甾体,除了在生殖和内分泌系统发挥作用,还可影响神经系统功能包括促进神经细胞存活,抑制细胞凋亡,抑制炎症反应等。研究发现孕酮可促进PI3K/AKt信号通路激活,调节脑源性神经营养因子(brain derived neurophic factor,BDNF)的合成与释放。但是关于孕酮发挥神经保护作用的机制尚未全完阐明。一方面,孕酮可与其经典核受体结合,通过经典基因途径发挥调节作用;另一方面,可与细胞膜上GABA_A受体、NMDA受体、PGRMC1/2受体等结合,通过非基因途径发挥快速调节作用。越来越多的证据表明孕酮可通过非经典受体机制发挥作用,其中研究最多的是孕酮膜结合蛋白1(progesterone receptor membrane component 1,PGRMC1),其可能是孕酮发挥神经保护作用的重要靶点之一。本实验采用Aβ活性片断Aβ_(25-35)作用于原代培养的大鼠海马神经干细胞建立AD细胞模型,以APPswe/PS1dE9双转基因小鼠作为AD动物模型,分别研究了孕酮在细胞和动物水平对神经再生的影响及相关机制,为孕酮能用于AD的防治提供理论依据。第一部分孕酮对AD细胞模型神经再生的影响目的:研究孕酮对AD细胞模型神经干细胞存活,增殖,凋亡及分化的影响。方法:取新生SD大鼠海马组织进行体外分离培养及诱导分化,Immofluorescence方法检测神经干细胞标志物Nestin、诱导分化后成熟神经元标志物βⅢ-Tubulin及星形胶质细胞标志物GFAP的表达情况;采用Aβ_(25-35)处理大鼠海马神经干细胞,建立AD细胞模型,应用CCK-8、Brdu掺入法(Brdu Elisa)、Western blot、Immofluorescence、流式细胞术等检测方法系统性的研究孕酮对Aβ_(25-35)诱导的神经干细胞存活、增殖、凋亡及分化的影响。结果:1.大鼠海马神经干细胞的分离培养、诱导分化及鉴定神经干细胞纯度90%,可诱导分化为神经元及星形胶质细胞。2.孕酮对AD细胞模型神经干细胞存活、增殖及凋亡的影响CCK-8结果显示,与对照组相比,20μM Aβ_(25-35)作用48后,大鼠海马神经干细胞明显损伤,细胞存活率为对照组的(59.3±6.4)%(P0.01);与Aβ组比较,孕酮能浓度和时间依赖地促进Aβ诱导的NSCs存活。在0.01-10μM范围内,1μM孕酮对Aβ处理神经干细胞48h,促进存活率作用最显著,其存活率为对照组的(89.6±4.7)%(P0.01)。Immofluorescence结果显示,Brdu阳性标记位于增殖期细胞核内,定位准确。与对照组相比,Aβ损伤组Brdu阳性增殖细胞显著减少(P0.01)。与Aβ组相比,孕酮保护组Brdu阳性细胞显著增多(P0.01)。与Brdu掺入法结果一致。Western blot结果显示,Aβ诱导的模型组胞浆中cleaved-caspase 3表达水平为对照组的2.6倍,显著高于对照组(P0.01)。与模型组相比,Aβ与PROG共孵育后cleaved-caspase 3表达水平无显著性差异(P0.05)。3.孕酮对AD细胞模型神经干细胞分化的影响Immofluorescence结果显示,与对照组相比,Aβ组DCX~+阳性细胞数显著降低,分化成神经元前体细胞突起显著缩短(P0.01)。与Aβ组比较,PROG保护组DCX~+阳性细胞数显著升高,细胞突起显著延长(P0.01)。流式细胞术结果显示,与对照组相比,Aβ损伤组分化成βⅢ-Tubulin、GFAP阳性细胞的百分率显著降低(P0.05)。与Aβ组比较,PROG组分化成βⅢ-Tubulin阳性细胞的百分率显著升高(P0.01),分化成GFAP阳性细胞的百分率无显著性差异(P0.05)。小结:1.孕酮能浓度和时间依赖地提高Aβ_(25-35)诱导AD细胞模型神经干细胞的存活率,促进其增殖,对神经干细胞凋亡无影响。2.孕酮促进Aβ_(25-35)诱导的神经元前体细胞新生,促进其突起生长。同时逆转Aβ_(25-35)抑制分化的作用,促进向神经元分化。第二部分孕酮对AD细胞模型神经干细胞细胞周期的影响目的:研究孕酮对AD细胞模型神经干细胞细胞周期及其相关蛋白Cyclin D1、PCNA表达水平的影响。方法:在大鼠海马培养神经干细胞Aβ损伤所致AD细胞模型的基础上,以神经甾体孕酮作为干预物,应用流式细胞术检测细胞周期的变化;应用Western blot技术,检测细胞周期相关蛋白Cyclin D1、PCNA表达。结果:1.孕酮对AD细胞模型NSCs细胞周期的影响与对照组相比,Aβ组G0/G1期细胞显著增多,S期细胞显著减少,增殖指数(PI)显著降低(P0.05)。与Aβ组相比,孕酮保护组G0/G1期细胞显著降低,S期细胞显著增多,PI显著升高(P0.05)。2.孕酮对AD细胞模型中NSCs细胞周期相关蛋白Cyclin D1、PCNA表达水平的影响Western-blot检测显示,与对照组相比,Aβ组Cyclin D1、PCNA蛋白表达水平显著降低(P0.05)。与Aβ组相比,孕酮保护组Cyclin D1、PCNA蛋白表达水平显著升高(P0.05)。小结:孕酮能够逆转Aβ所致G0/G1期细胞阻滞,上调细胞周期相关蛋白Cyclin D1、PCNA的表达水平,促进神经干细胞增殖。第三部分孕酮对AD细胞模型神经干细胞AKt/CREB/BDNF信号通路的影响目的:研究神经甾体孕酮对CREB信号通路及其上游PI3K/AKt,下游BDNF三者之间调控作用。方法:应用Western-blot、Brdu掺入法、流式细胞术分别检测孕酮和Rolipram(p-CREB激活剂)对Aβ诱导的神经干细胞CREB、BDNF的表达,增殖和分化的影响;应用上述方法检测孕酮和LY294002(PI3K/AKt通路抑制剂)对Aβ诱导的神经干细胞AKt、CREB及BDNF的表达,增殖和分化的影响。结果:1.孕酮对AD细胞模型中神经干细胞CREB/BDNF的影响Western-blot结果显示:与Aβ损伤组相比,PROG保护组和Rolipram处理组均能引起p-CREB(Ser133)、BDNF蛋白表达显著升高(P0.05),各组T-CREB表达水平组间无显著性差异(P0.05)。Brdu掺入法及流式细胞术结果显示:与模型组比,PROG保护组和Rolipram预处理组显著促进神经干细胞的增殖及向神经元分化(P0.05)。2.孕酮AD细胞模型中神经干细胞PI3K/AKt的影响Western blot结果显示:与Aβ损伤组相比,孕酮保护组能够引起p-AKt(Ser473)蛋白表达显著升高(P0.05);与PROG保护组相比,LY294002组p-AKt蛋白表达显著降低(P0.05),各组T-AKt、T-CREB表达水平组间无显著性差异(P0.05)。此外,各处理组神经干细胞p-CREB、BDNF变化水平与p-AKt一致。Brdu掺入法及流式细胞术结果显示:与模型组比,孕酮组显著促进神经干细胞增殖及向神经元分化(P0.05)。与PROG保护组相比,LY294002预处理组显著抑制NSCs的增殖及向神经元分化(P0.05)。小结:孕酮促进PI3K/AKt-CREB信号通路的激活,上调BDNF的表达,发挥促进AD细胞模型神经干细胞增殖与神经元样分化作用。第四部分孕酮促进AD细胞模型神经再生PGRMC1作用的研究目的:研究孕酮是否通过PGRMC1介导AKt/CREB/BDNF信号通路发挥保护作用。方法:应用Immofluorescence检测PGRMC1和classic PR在神经干细胞的表达情况;Western blot检测Aβ对神经干细胞PGRMC1表达的影响;构建PGRMC1慢病毒载体,慢病毒感染NSCs筛选最佳转染复数(MOI)及时间;PCR、Western Blot、Brdu Elisa检测慢病毒感染神经干细胞后PGRMC1基因和蛋白的表达情况及慢病毒对神经干细胞增殖的影响;Western Blot、Brdu Elisa、流式细胞术检测PGRMC1 siRNA对神经干细胞增殖和分化及AKt、CREB、BDNF表达的影响结果:1.PGRMC1在神经干细胞的胞体和细胞核均有表达,classic PR在神经干细胞中无表达。2.Aβ对神经干细胞中PGRMC1表达的影响Western blot结果显示,Aβ处理48h后,PGRMC1表达显著升高。与Ctr组相比,Aβ组PGRMC1的相对表达量增加了67%(P0.05)。3.慢病毒转染NSCs筛选最佳感染复数(MOI)及时间各组神经干细胞加入慢病毒培养液,于荧光显微镜下观察,慢病毒感染48h,GFP绿色荧光强度随着MOI值增加而增加,ENi.s+Poly组相比于其它组GFP绿色荧光强度显著增强(P0.05)。当MOI值为20时,GFP绿色荧光分布均匀,大量表达。以MOI值20感染神经干细胞,随着时间的延长,GFP绿色荧光从微弱逐渐增强,48h后,与对照组相比,GFP绿色荧光强度显著增强(P0.05),因此慢病毒感染神经干细胞最佳培养液为ENi.s+Poly,MOI值为20,时间为48h,用于后续实验。4.慢病毒感染神经干细胞后PGRMC1基因及蛋白表达水平及增殖的变化NSCs正常组和Scrambled siRNA(随机序列作为感染阴性对照)组PGRMC1基因和蛋白正常表达。与正常对照组相比,siRNA 61634基因和蛋白表达显著降低(P0.05)。同时Brdu Elisa结果显示,与对照组相比,各转染组神经干细胞增殖无显著性差异(P0.05)。说明siRNA 61634干扰效果较好,可用于后续实验。5.PGRMC1 siRNA对AKt/CREB/BDNF信号通路的影响Western blot结果显示:与孕酮保护组相比,siRNA 61634处理组p-CREB蛋白表达显著降低(P0.05),大鼠海马神经干细胞中p-AKt、BDNF变化水平与p-CREB一致。Brdu Elisa及流式细胞术结果显示:与孕酮保护组相比,siRNA 61634处理组显著抑制了神经干细胞的增殖及向神经元样分化作用(P0.05)。小结:孕酮部分通过PGRMC1介导调控AKt/CREB/BDNF信号通路通路,促进神经干细的增殖与分化。第五部分孕酮对APP/PS1转基因小鼠神经再生和学习记忆的影响目的:研究孕酮对APP/PS1转基因小鼠海马区新生神经元存活、分化成成熟神经元、空间学习记忆的影响及其相关机制方法:选取APP/PS1转基因小鼠作为AD动物模型,颈部皮下注射孕酮,腹腔注射Brdu。应用Immofluorescence检测海马区28天龄Brdu~+、Brdu~+/NeuN~+细胞数,p-AKt、p-CREB蛋白着色情况;应用BDNF Elisa试剂盒检测血清中BDNF变化;应用Morris水迷宫检测小鼠学习记忆行为学的改变。结果:1.孕酮对APP/PS1转基因鼠海马区新生神经元存活及分化成成熟神经元的影响Immofluorescence结果显示:与APP/PS1转基因小鼠组比,PROG处理可显著增加APP/PS1小鼠28天龄-Brdu~+和Brdu~+/NeuN~+数量(P0.05)。2.孕酮对APP/PS1转基因小鼠海马区AKt/CREB/BDNF信号通路的影响结果显示:APP/PS1小鼠脑区p-AKt、p-CREB蛋白着色不明显;与APP/PS1转基因小鼠相比,经孕酮治疗后的小鼠脑区p-AKt、p-CREB蛋白表达显著升高(P0.05)。BDNF Elisa结果显示:与APP/PS1转基因小鼠相比,经孕酮治疗后的血液上清液中BDNF显著升高(P0.01)。3.孕酮对APP/PS1转基因小鼠学习记忆行为学的影响Morris水迷宫结果显示:在定位航行实验中:三组小鼠平均游速之间无统计学差异(P0.05),三组小鼠逃避潜伏期均随学习天数增加而缩短。孕酮治疗组小鼠逃避潜伏期较APP/PS1组显著缩短(P0.01)。空间探索实验结果显示:与APP/PS1组相比,孕酮组小鼠穿越平台区的次数及平台所在象限停留时间百分比均显著增加(P0.01)。小结:孕酮促进APP/PS1小鼠海马区神经发生,激活AKt/CREB/BDNF信号通路,进而改善APP/PS1转基因小鼠空间学习记忆能力。结论:1.孕酮能浓度和时间依赖地提高Aβ_(25-35)诱导AD细胞模型神经干细胞的存活率,促进NSCs增殖。且发挥促进神经元前体细胞新生及其突触生长,促神经元样分化作用。2.孕酮能够逆转Aβ所致的G0/G1期细胞阻滞,上调Cyclin D1、PCNA的表达;同时通过促进PI3K/AKt-CREB信号通路的激活,上调BDNF的表达水平,促进AD细胞模型中神经干细胞的增殖与向神经元样分化。3.孕酮部分通过PGRMC1介导调控AKt/CREB/BDNF信号通路。4.孕酮促进APP/PS1小鼠海马区神经发生,激活AKt/CREB/BDNF信号通路,改善APP/PS1转基因小鼠空间学习记忆能力。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R749.16
【图文】：

诱导分化,干细胞,纯度

图 1-1 新生大鼠海马神经干细胞纯度及诱导分化鉴定1 The identify in purity and differentiation of rat hippocampal neurstem cells.l stem cells stained for Nestin (red), neurons stained for βⅢ-Tubuli), astrocyte stained for GFAP (red) and DAIP was used to stain nucl(blue). Scale bar = 50 μm

孕酮,神经干细胞,存活率,细胞模型

34图 1-2 孕酮促进 AD 细胞模型神经干细胞存活率-2 Progesterone promotes the viability of NSCs in the AD cell modeogesterone increases viability of NSCs treated by Aβ inpendent manner. NSCs cultures were exposured to 20μM Aβ25 35wout different concentration of progesterone for 48h, and then assayK-8. (B) Progesterone increases viability of NSCs treated by Aβpendent manner. NSCs cultures were exposed to 20μM Aβ25 35with 1μM progesterone for the indicated times, and then assayed for c. Data are expressed as mean ±SD.△△P<0.01 compared with con1 compared with Aβ.*P<0.05 compared with Aβ.

【参考文献】