aFGF调控GSK3β-CRMP2信号通路促进突起生长在AD治疗中的分子机制研究

发布时间：2020-06-21 10:49

【摘要】：目的:本研究以GSK3β为靶点,通过免疫共沉淀偶联LTQ-Orbitrap蛋白组学技术筛选出与之相互作用的蛋白,来阐明aFGF_(14-154)及其改构体(Tat-aFGF_(14-154))拮抗Aβ_(1-42)诱导的神经毒性作用的分子机制,为阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的新药开发提供一定的理论基础。方法:采用Western Blotting的方法检测不同浓度的aFGF_(14-154)、Tat-aFGF_(14-154)对N2a-APP细胞中GSK3β蛋白表达及其磷酸化的影响,采用MTT法和Western Blotting的方法摸索GSK3抑制剂BIO的给药浓度,采用免疫荧光方法观察aFGF_(14-154),Tat-aFGF_(14-154),GSK3抑制剂BIO对Aβ_(1-42)损伤的大鼠原代皮质神经元突起的影响。用过表达APP的细胞(N2a-APP)为模型,aFGF_(14-154)和Tat-aFGF_(14-154)采用最佳作用浓度作用细胞后,收取蛋白用GSK3β抗体进行免疫共沉淀(Co-IP),结合LC-MS/MS(LTQ-Orbitrap)蛋白质谱技术,鉴定与GSK3β相互作用的蛋白。采用生物信息学分析GSK3β互作的蛋白质,使用Co-IP结合Western blotting的方法验证所筛选蛋白与GSK3β之间的相互作用关系。分别用GSK3β特异抑制剂、aFGF_(14-154)和Tat-aFGF_(14-154)处理细胞后,以Western blotting的方法检测所筛选蛋白的表达是否有差异。用Aβ_(1-42)处理的大鼠原代皮质神经元建立AD模型,采用Western blotting检测aFGF_(14-154)和Tat-aFGF_(14-154)不同处理时间对CRMP2的蛋白表达及其磷酸化水平的影响;siRNA沉默CRMP2的蛋白表达,用MTT法、Western blotting、扫描电镜和免疫荧光技术考察CRMP2蛋白在aFGF_(14-154)和Tat-aFGF_(14-154)拮抗Aβ_(1-42)导致的神经元突起损伤中的关键作用。结果:(1)aFGF_(14-154)和Tat-aFGF_(14-154)修复被Aβ_(1-42)损伤的皮质神经元细胞活性,促进神经元突起的再生;GSK3抑制后aFGF的神经保护作用显著减弱。(2)GSK3β总蛋白表达不变的前提下,aFGF_(14-154)和Tat-aFGF_(14-154)促进N2a-APP细胞中GSK3β(Ser9)的蛋白磷酸化;免疫共沉淀联合质谱技术鉴定出与GSK3β相互作用的靶蛋白,通过生物信息学、文献调研,筛选出了与神经元突起、轴突和树突发育与形成相关的蛋白(MAP1B、eEF2、CRMP2、CRAM5、PP2A B、TDP43);Co-IP联合Western blotting的方法,验证了CRMP2、CRAM5和GSK3β的相互作用;GSK3β抑制剂AR显著下调p-GSK3?的水平和CRMP5的蛋白表达,几乎完全抑制CRMP2的磷酸化水平。(3)在N2a-APP细胞中,aFGF_(14-154)上调GSK3β(Ser9)的蛋白磷酸化的同时,抑制CRMP2(Thr514)的蛋白磷酸化,而GSK3β和CRMP2总蛋白水平保持不变;在Aβ_(1-42)损伤的大鼠皮质神经元模型中,aFGF_(14-154)和Tat-aFGF_(14-154)作用24h后均可促进GSK3β(Ser9)的磷酸化,减少CRMP2(Thr514)的磷酸化,而GSK3β和CRMP2总蛋白水平仍然保持不变。(4)在Aβ_(1-42)损伤的大鼠皮质神经元模型中,利用siRNA沉默CRMP2蛋白的表达,阻断了aFGF_(14-154)和Tat-aFGF_(14-154)提升细胞活力的效应,逆转了它们对突触相关蛋白SYN和PSD95的表达上调作用。细胞形态学上也显示神经元胞体和突起再度恢复到Aβ_(1-42)损伤状态,包括扫描电镜观察到胞体皱缩、扁平,表面突起数量减少,已有的神经突起变短、中断;通过免疫荧光技术,以神经元特异性微管相关蛋白2(MAP2)表征的神经元突起长度缩短,突起间交错形成的网络状结构基本消失。结论:在体外AD细胞模型中,aFGF_(14-154)和Tat-aFGF_(14-154)以CRMP2为靶点,通过促进GSK3β(Ser9)的磷酸化,抑制GSK3β的活性来减少CRMP2(Thr514)的磷酸化,促进了Aβ_(1-42)损伤的大脑皮质神经元的突起再生,从而发挥它们的神经保护作用。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R749.16
【图文】：

结构图,结构图,基端,生物酶

图 1.1 GSK3β 蛋白质结构图Fig.1.1 The structural features ofGSK3β基端的一个丝氨酸（GSK3β 的 Ser9 或[18]；相反，磷酸化 GSK3 的酪氨酸位点（可促进其活性。最初发现 GSK3β 的生物酶活性，从而减少糖原的合成[19; 20]。随GSK3，对其下游的各种转录因子、跨膜。GSK3 是一种多样性的激酶，不同的的活性，从而影响多种生理过程。GSK3症性疾病、癌症、糖尿病、AD、骨质路之间的串扰是疾病、发育和内环境稳

序列,磷酸化,底物

性影响底物功能的变化，当 GSK3 氨基酸残基靶向突变为丙活性无影响。GSK3 底物共识别序列是 Ser/ThrXXX，其中 X3 具有磷酸盐结合口袋，当 GSK3ɑ/β 的 Ser21/9 磷酸化可导致酸盐结合口袋相互作用，阻止其对底物的识别，使 GSK3 失态的 GSK3 可以磷酸化糖原合酶的 Ser652，Ser648，Ser644 和蛋白中的 Ser41，Ser37 和 Ser33 残基[27]。GSK3 对大多数底物他的蛋白激酶先预磷酸化底物的氨基酸残基上某个 Ser/Thr[28序列是 C 端的四个残基 S/T-X-X-X-S/T(P)，使底物结合到由正电荷位点，诱导 GSK3 磷酸化底物 N 末端的几个丝氨酸/苏CREB 通过 PKB 磷酸化 Ser133，促使 GSK3 磷酸化 CREB 的REB 转录活性。当底物是低浓度时，GSK3 的 Ser9 磷酸化后着底物浓度增加时，底物可被 GSK3 再次磷酸化，说明底物的 GSK3 的活性[27]。

【参考文献】