从Tau蛋白过度磷酸化探讨宫内窘迫后新生鼠学习记忆障碍的分子机制和预防措施

发布时间：2020-06-26 08:21

【摘要】：Tau蛋白是功能性的结构不对称磷蛋白,属于微管蛋白(Microtubule associated protein, MAP),其作用是起到稳定脑内神经细胞轴突微管的空间立体结构,从而保持神经细胞轴突微管之间的距离合适,保证神经递质等介质在神经细胞轴突的正常运输。神经细胞正常生理功能的调节主要是由Tau蛋白的磷酸化程度决定的,正常磷酸化的Tau蛋白起到稳定神经细胞轴突微管的功能,而过度磷酸化的Tau蛋白能使微管立体空间发生不稳定变化,微管的正常装配过程受到抑制,最终导致大多数神经细胞的递质传递障碍,引起机体发生学习和记忆功能障碍。胎儿宫内窘迫后可出现学习记忆功能受损的原因,可能是与神经组织内异常的谷氨酸(Glutamic acid, Glu)信息传递系统有关,Glu信息传递异常可以引起神经细胞的应激反应,导致海马组织广泛的长时程增强效应(long-term potentiation, LTP)饱和状态,造成神经细胞突触可塑性障碍。Glu及其受体参与了神经细胞的突触传递兴奋性,与学习和记忆有关；一旦Glu过度兴奋可引起神经细胞的快速去极化,去极化的结果会引起Cl-、Na+、H2O和Ca2+大量内流,导致神经细胞内Ca2+超载,通过磷酸肌醇环路的激活破坏神经细胞的超微结构,最终导致神经细胞溶解、凋亡或死亡。N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-d-aspartic acid receptor, NMDAR)拮抗剂5-甲基二氢丙环庚烯亚胺马来酸(MK-801)和使君子酸受体(a-amino-3-hydroxy-5-methyl-isoxazole-4-propionic acid receptor,AMPA R)拮抗剂纯品二硝基喹酮(DNQX)作为Glu受体(GluR)的有效拮抗剂,可降低由冷水刺激引起的Tau蛋白磷酸化的水平,说明强应激可以通过Glu信息传递系统的激活来调节Tau蛋白磷酸化的程度,影响神经细胞的兴奋性传递系统。海马组织内Tau蛋白的过度磷酸化的原因可能是由于强应急引起的Glu信息传递系统的过度激活造成的。胎儿宫内窘迫的主要原因是宫内胎儿的血供绝对或相对下降引起的,造成胎儿出生后学习和记忆等脑功能下降,但其具体的发病机制不明。由于血供不足引起的缺血缺氧强应激是否会引起的Glu信息传递系统异常,导致Tau蛋白过度磷酸化,造成学习记忆等脑功能障碍?假如是,那GluR阻滞剂和具有GluR阻滞作用的药物可否逆转此过程?第一部分不同程度和时间阻断子宫动脉对鼠海马组织内Glu的浓度的影响目的：观察不同程度和时间阻断子宫动脉的宫内窘迫干预对胎鼠海马Glu浓度的影响。方法：建立宫内窘迫的大鼠模型,采用3×3析因设计：阻断子宫动脉的程度(3水平：轻度阻断、中度阻断、完全阻断)和阻断时间(3水平：5min.10min.15 min)的所有组合。随机将72只大鼠分为9个组(n=8)：LL组(轻度阻断,5min)lLM组(轻度阻断,10min);LH组(轻度阻断,15 min);ML组(中度阻断,5min);MM组(中度阻断,10 min);MH组(中度阻断,15 min);HL组(完全阻断,5 min);HM组(完全阻断,10min)；HH组(完全阻断,15 min)。全部胎儿宫内窘迫制模结束后,剖宫取出胎鼠,留取海马,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)检测Glu在海马中的含量。结果：宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激诱发海马Glu浓度升高：在宫内窘迫造模中,子宫动脉的阻断程度和阻断时间均可明显影响这一过程,两者作用叠加。结论：本实验发现宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激后胎鼠海马组织内Glu浓度明显升高,而且海马组织中Glu浓度随阻断子宫动脉的程度和阻断时间而增加。提示我们在临床治疗中应积极改善子宫动脉的供血,可减轻胎儿宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激后的胎儿机体神经细胞损伤。第二部分NMDA受体拮抗剂和AMPA受体拮抗剂对宫内窘迫后新生鼠学习记忆障碍和Tau蛋白过度磷酸化的影响目的：通过对GluR拮抗剂对宫内窘迫后新生鼠学习记忆能力和对Tau蛋白过度磷酸化程度观察,分析GluR拮抗剂对新生鼠学习记忆能力的影响及其可能机制的分析。方法：采用2×3析因设计：宫内窘迫是和否(2水平：否、宫内窘迫即中度阻断孕鼠的子宫动脉持续10min)和GluR拮抗剂使用和否(3水平：注射生理盐水、NMDA受体拮抗剂MK-801、AMPA受体拮抗剂DNQX)的所有组合。随机将48只孕鼠随机6个实验组(n=8)：S组(经尾静脉注射2m1生理盐水)、M组(经尾静脉注射2ml NMDA受体拮抗剂MK-8015 mg/kg)、D组(经尾静脉注射2ml AMPA受体拮抗剂DNQX 5 mg/kg)、SE组(经尾静脉注射2 ml生理盐水+施行宫内窘迫即中度阻断孕鼠的子宫动脉持续10min)、ME组(经尾静脉注射2 ml NMDA受体拮抗剂MK-8015 mg/kg+施行胎儿宫内窘迫即中度阻断孕鼠的子宫动脉持续10min)、DE组(经尾静脉注射2 ml AMPA受体拮抗剂DNQX 5 mg/kg+施行胎儿宫内窘迫即中度阻断孕鼠的子宫动脉持续10min)。全部宫内窘迫处置结束后母鼠继续妊娠至足月,剖宫娩出新生鼠,待新生鼠生长至12W时进行Morris水迷宫(Morris water maze, MWM)检测学习记忆能力,检测后麻醉下处死新生鼠留取海马组织。高效液相色谱法(HPLC)法检测Glu在海马组织内的浓度；免疫组化SP (immunohistochemistry, IHC-SP)法检测Tau蛋白5(总Tau蛋白)以及磷酸化Tau蛋白p-PHF1Ser396/404、p-AT8Ser199/202、p-12E8Ser262在海马组织中的表达状况。结果：宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激可以造成实验新生鼠学习和记忆等脑功能障碍,即延长受试者的逃避潜伏期(escape latency,EL)、缩短受试者的空间探索时间(space exploration time, SET);宫内窘迫可明显增加海马组织中Glu的浓度；Glu受体的两种拮抗剂对海马组织内的Glu浓度没有显著的影响。宫内窘迫诱发的缺血缺氧和Glu受体的拮抗剂对海马组织内的总Tau蛋白表达没有明确影响。胎儿宫内窘迫诱发的缺血缺氧可增加海马组织中磷酸化Tau蛋白的表达；Glu受体拮抗剂可缓解海马组织内的Tau蛋白的过度磷酸化。结论：Glu受体的拮抗剂可以缓解胎儿宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激后的神经细胞损伤,其具体机制和阻断兴奋性毒性和缓解海马组织内Tau蛋白的超磷酸化程度有关。第三部分宫内窘迫后新生鼠学习记忆障碍的预防措施实验一：黄芪总苷对宫内窘迫后新生鼠海马组织中G1u浓度的影响目的：通过观察黄芪总苷对宫内窘迫模型后新生鼠海马组织内Glu浓度的影响。方法：按2×2析因设计设置：宫内窘迫是否(2水平：否、施行宫内窘迫即中度阻断孕鼠的子宫动脉持续10min)和黄芪总苷有无(2水平：尾静脉注射5 ml生理盐水或5 ml黄芪总苷40 mg/kg)的所有组合。40只24 W健康雌性SD大鼠建立宫内窘迫模型,建模结束后母鼠继续妊娠至新生鼠娩出,待新生鼠生长至12W时将32只新生鼠随机分为4个实验组(n=8)：S组(尾静脉注射5 ml生理盐水)、P组(尾静脉注射5 ml黄芪总苷40 mg/kg)、SE组(尾静脉注射5 ml生理盐水+中度阻断孕鼠的子宫动脉持续10min)、PE组(尾静脉注射5 ml黄芪总苷40 mg/kg+中度阻断孕鼠的子宫动脉持续1Omin)。全部宫内窘迫处置结束后母鼠继续妊娠至足月,剖宫娩出新生鼠,待新生鼠生长至12W进行Morris水迷宫检测,检测结束后取新生鼠的海马组织。使用HPLC检测在新生鼠海马组织中Glu的含量。结果：胎儿宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激可明显增加新生鼠海马组织中神经递质Glu的浓度；黄芪总苷可降低宫内窘迫后新生鼠海马组织中Glu的浓度。结论：胎儿宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激造成海马组织内Glu浓度过度升高,进而诱发学习记忆功能障碍,而黄芪总苷则可通过降低海马组织内过度升高的Glu浓度,从而改善胎儿宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激后的学习记忆能力。实验二：黄芪总苷和NMDA受体拮抗剂对宫内窘迫后新生鼠学习记忆障碍比较研究目的：通过观察黄芪总苷和NMDA受体拮抗剂MK-801对宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激后新生鼠Tau蛋白过度磷酸化的影响,探讨两者对Tau蛋白超磷酸化的调节,为临床治疗提供理论依据。方法：采用2×3析因设计：宫内窘迫是否(2水平：否、中度阻断孕鼠的子宫动脉持续10min)和药物(3水平：尾静脉注射生理盐水、NMDA受体拮抗剂MK-801、黄芪总苷)的所有组合。随机48只宫内窘迫模型大鼠随机分为6组(n=8)：I组(5 ml生理盐水iv)；II组(5m1MK-801 ⅳ,10mg/kg);Ⅲ组(5m1黄芪总苷ⅳ,200mg/kg);Ⅳ组(5 ml生理盐水iv+中度阻断孕鼠的子宫动脉持续10min)；V组(5 ml MK-801 ⅳ, 10mg/kg+中度阻断孕鼠的子宫动脉持续10min);Ⅵ组(5ml黄芪总苷iv,200 mg/kg+中度阻断孕鼠的子宫动脉持续10min)。宫内窘迫处置结束后母鼠继续妊娠至足月,剖宫娩出新生鼠,待新生鼠生长至12W时麻醉下断头取海马,HPLC法检测海马组织中的Glu的含量,IHC-SP法检测海马组织中p-AT8Ser202和GSK-3β1H8的表达。结果：宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激可明显增加海马组织内神经递质Glu的浓度；黄芪总苷可降低宫内窘迫后海马组织内Glu浓度；而MK-801对海马组织中Glu的浓度无明显影响。宫内窘迫可增加海马组织内超磷酸化的Tau蛋白p-AT8Ser202以及促进Tau蛋白过度磷酸化的调控蛋白GSK-3β1H8的表达；黄芪总苷和MK-801效果相似均可缓减海马组织内p-AT8Ser202及促进其磷酸化的GSK-3β1H8表达,且和宫内窘迫的影响呈相减效果。结论：黄芪总苷可以通过降低海马Glu浓度减缓Tau蛋白的磷酸化；GSK-3β是该信号通路的关键蛋白；黄芪总苷改善宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激后的学习记忆能力的效果优于MK-801。实验三：黄芪总苷、人参皂苷Rg-1、蛋白磷酸酯酶-2A和氯化锂对宫内窘迫后新生鼠海马组织Glu浓度的影响目的：观察黄芪总苷、人参皂苷Rg-1、蛋白磷酸酯酶-2A和氯化锂对宫内窘迫后新生鼠海马内Glu浓度和的影响。方法：采用2×5析因设计：宫内窘迫是否(2水平：否、中度阻断孕鼠的子宫动脉持续10min)和药物干预(5水平：通过子宫动脉微量注射生理盐水、黄芪总苷、人参皂苷Rg-1、蛋白磷酸酯酶-2A、氯化锂,20μ g·1 μ L-1)的所有组合。随机将80只大鼠分10个实验组(n=8)：Ⅰ组(子宫动脉注射1μl生理盐水)；Ⅱ组(子宫动脉注射1μl黄芪总苷,20μg)；Ⅲ组(子宫动脉注射1μl人参皂昔Rg-120μg)；Ⅳ组(子宫动脉注射1μl蛋白磷酸酯酶-2A 20μg)；V组(子宫动脉注射1μl氯化锂20μg)； Ⅵ组(子宫动脉注射1μl生理盐水+中度阻断孕鼠的子宫动脉持续10min)；Ⅶ组(子宫动脉注射1μl黄芪总苷纯品,20μg+中度阻断孕鼠的子宫动脉持续10min)；Ⅷ组(子宫动脉注射1 μl人参皂苷Rg-120μg+中度阻断孕鼠的子宫动脉持续10min)；Ⅸ组(子宫动脉微量1μl氯化锂20μg+中度阻断孕鼠的子宫动脉持续10min)； X组(子宫动脉注射1μl蛋白磷酸酯酶-2A 20μg+中度阻断孕鼠的子宫动脉持续10min)。宫内窘迫处置结束后母鼠继续妊娠至足月,剖宫娩出新生鼠,待新生鼠生长至12W时麻醉下断头取海马组织。通过HPLC法检测海马组织内Glu的含量,通过蛋白质免疫印迹法(Western-blotting)检测Tau蛋白-5和p-AT8Ser202在海马组织中的表达。结果：宫内窘迫可明显增加海马中Glu浓度、黄芪总苷和人参皂苷Rg-1在有、无宫内窘迫均可减少Glu浓度；蛋白磷酸酯酶-2A、氯化锂对胎儿宫内窘迫后海马内Glu浓度没有明显影响。结论：双黄芪总苷和人参皂苷Rg-1可以用于预防和治疗宫内窘迫后学习记忆等脑功能障碍；氯化锂和蛋白磷酸酯酶-2A因对海马组织的Glu浓度没有明显影响,不建议用于治疗。其原因推测为四种药物作用机制不同造成的,具体机制需要进一步研究。全文结论1 宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激诱发海马谷氨酸浓度升高,子宫动脉的阻断程度和阻断时间均可明显影响这一过程,两者作用叠加。2宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激诱发海马组织内的谷氨酸浓度明显升高,谷氨酸激动谷氨酸受体,从而通过上调糖原合成酶激酶-3β增加海马Tau蛋白的磷酸化程度,从而诱发学习记忆障碍。3 谷氨酸受体拮抗剂(例如N-甲基-D-天冬氨酸受体受体拮抗剂MK801)、黄芪总苷通过降低海马谷氨酸浓度下调糖原合成酶激酶-3β的表达,从而减缓Tau蛋白的磷酸化程度以改善宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激后的学习记忆能力。4黄芪总苷改善大鼠宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激后学习记忆能力的效果优于N-甲基-D-天冬氨酸受体受体拮抗剂。5人参皂昔亦能降低改善宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激后海马组织内过度升高的谷氨酸浓度,从而缓解宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激导致的神经元兴奋性毒性,其作用效果与黄芪总苷相类似。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.94

【参考文献】