阿尔茨海默病患者血清中外泌体的提取鉴定及蛋白质组学研究

发布时间：2020-07-04 05:20

【摘要】：阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以进行性记忆力减退、认知功能下降和人格改变为主要临床表现的中枢神经系统退行性疾病,是老年期痴呆中最常见的一种类型,其病理特征为大脑皮层和海马出现β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)聚集形成的老年斑、Tau蛋白聚集形成的神经纤维缠结(NFTs)以及神经细胞大量减少丢失。AD病理改变发生的中心环节是Aβ沉积,在AD发病及病理进展中具有十分重要的作用。我国是目前世界上唯一一个老年人口超过1亿的国家,因此AD患病人数迅速增长,是老龄化社会面临的最重要卫生健康问题,亟需提高痴呆的识别率和早期诊断率。目前所使用的阿尔茨海默病诊断标准基本上都是以临床表现为基础,再结合相关病史、精神状态、认知及心理学测试结果,并排除其他可能导致痴呆综合征的疾病。2011年发表的AD诊断标准(NIA-AA)纳入了生物标志物,即功能影像学显示特殊脑皮层区葡萄糖代谢率下降或Aβ42降低或/和tau蛋白升高,然而由于受到资源和操作程序等因素的限制,生物标志物不能广泛运用于AD的诊断性筛查。并且在AD临床症状出现之前,AD的病理改变已经发生了多年。因此,AD的临床诊断远远滞后于AD的发生发展,以致于无法做到真正意义上的早期诊断和防治。外泌体(exosomes)是一种直径约为40~150nm的圆形或椭圆形单层囊泡结构,可由机体许多类型的细胞释放。外泌体能在体液中稳定存在,而同时由于其体积小可避免被单核巨噬细胞吞噬,且能自由地透过血管壁及细胞外基质,因此可在血液、乳液、尿液、唾液等体液中广泛存在,最终可实现与周围细胞的膜融合及生物膜的循环。外泌体能够运载各种生物活性分子,且种类繁多,包括了蛋白质、脂质以及核酸成分等,能够从多途径、多位点上对受体细胞的信息进行调节,从而有效地提高了调节的程度以及精细度,更加符合机体的需要。但外泌体的这种交流能力并非都会产生有利的结果,有时这些变性蛋白或者致病性蛋白的转运将会进一步加重神经系统疾病的发展,比如有体外实验证明外泌体能够通过细胞间运输与帕金森病相关的α-突触核蛋白。有相关研究表明,外泌体能够释放与AD相关的Aβ,使这些蛋白在脑内的沉积过程进一步加剧。外泌体包含多种蛋白质和遗传物质,被认为是疾病的生物标志物。近些年,外泌体的研究逐步用于临床诊断和治疗,如外泌体microRNA可作为肺癌的诊断标志物,尿液样本中的外泌体蛋白图谱还能协助肾脏疾病的诊断,外泌体可通过降低AD患者β淀粉样蛋白起治疗AD作用。目的:拟分离鉴定阿尔茨海默病患者和正常老年对照者血清中外泌体,并利用蛋白质组学技术对从血清中分离出来的外泌体进行差异蛋白质的筛选研究,试图寻找与阿尔茨海默病发病相关的蛋白质分子,为探索阿尔茨海默病早期诊断及防治的生物靶标提供理论依据。方法:用ExoQuick试剂盒提取阿尔茨海默病患者及正常老年对照者血清中外泌体;透射电镜观察其形态特征,western blot鉴定外泌体的表面标志物CD63;BCA法对提取的外泌体进行蛋白定量测定;对分离出的外泌体进行双向凝胶电泳和质谱分析鉴定差异蛋白。结果:1.透射电镜下观察血清中外泌体均为既往文献报道的典型的圆形或椭圆形囊泡结构,平均直径在30-150nm,有完整脂质包膜;2.Western blot验证结果表明外泌体特异性标志物CD63在血清来源的外泌体中均表达阳性;3.双向凝胶电泳筛选出差异表达3倍以上的差异蛋白点约26个,其中阿尔茨海默病患者中相对正常对照组表达上调的有10个,表达下调的有16个,选取其中3个蛋白点做质谱分析并鉴定蛋白名称为:维生素D结合蛋白(Vitamin D-binding protein,VTDB),CD5抗原(CD5 antigen-like,CD5L),免疫球蛋白重链(Immunoglobulin heavy constant mu,IGHM)。结论:1.成功从阿尔茨海默病患者的外周血清中分离出外泌体,为深入研究外泌体蛋白与阿尔茨海默病发病机制的关系提供了良好的技术基础。2.筛选鉴定出的3个差异蛋白:维生素D结合蛋白(Vitamin D-binding protein,VTDB),CD5抗原(CD5 antigen-like,CD5L),免疫球蛋白重链(Immunoglobulin heavy constant mu,IGHM)可能与AD的发病相关,可为寻找阿尔茨海默病发病机制的生物标志物提供候选蛋白。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R749.16
【图文】：

技术路线图

基本流程,蛋白质

蛋白质质谱鉴定基本流程

【参考文献】