老龄脑及额颞叶痴呆的蛋白质组学研究

发布时间：2020-07-06 08:58

【摘要】：研究意义 随着人口老龄化进程的加速，老年变性性痴呆已成为日益严重的社会和医疗问题，对脑老化及痴呆的病理机制和防治研究受到高度重视。老龄脑和变性性痴呆患者脑具有相互重叠的病理和生化改变，提示脑老化是变性性痴呆的发病基础，二者之间有相互联系的分子机制。 新近出现的蛋白质组学可以比较两个或更多的样品之间蛋白质整体表达水平，是揭示疾病分子机制，发现疾病标志蛋白，寻找新的药物靶标的理想工具，也是生命科学进入后基因组时代的标志之一。由于技术水平限制或脑标本较难得到等原因，目前仅有少量对阿尔茨海默病及老龄大脑进行蛋白质组分析的报道。额颞叶痴呆是老年变性性痴呆的重要类型，但迄今尚没有专门针对额颞叶痴呆的脑蛋白质组学研究。大量证据显示阿尔茨海默病患者的小脑病损轻微，因此对小脑的蛋白质表达深入研究或许可以帮助我们揭示脑老化及变性痴呆的分子机制，但迄今亦没有专门针对老龄小脑的蛋白质组学研究。 本文采用蛋白质组学技术对老龄人脑、额颞叶痴呆患者脑进行研究，旨在发现脑老化及额颞叶痴呆相关蛋白质，以深入理解脑老化及额颞叶痴呆分子机制。并为寻找早期诊断治疗额颞叶痴呆的有效方法提供实验依据。 研究方法 经病理证实的额颞叶痴呆患者及正常老年人尸检脑标本均取自解放军总医院。脑组织经蛋白提取、第一向等电聚焦电泳、第二向垂直SDS-PAGE电泳后、以银染或考马斯亮兰R250显色。透射扫描双向电泳凝胶，所得图谱以ImageMaster 2D Elite软件进行图像分析。将感兴趣蛋白质点从考马斯亮兰染色的凝胶上切下，胶内蛋白质酶解。以MALDI-TOF质谱或MALDI-TOF／TOF串联质谱技术结合数据库检索 博士学位论文 摘要 对蛋白质进行鉴定. 研究内容 I老年人小脑组成蛋白质组初步研究 选取3例正常老年人小脑组织为研究对象，进行了小脑蛋白质双向 电泳展示，以生物质谱技术鉴定了表达量较高的88个蛋白质，包括中间 代谢酶类，细胞骨架蛋白、杭氧化蛋白、神经元特异蛋白、信号蛋白等. 初步建立了老年人小脑蛋白质组数据库. 11不同年龄人小脑比较蛋白质组学研究 针对人小脑蛋白质在衰老过程中的差异表达进行研究.老年人及成 年人、胎儿死亡后的小脑蛋白质通过双向电泳分离.使用ImageMasterZD 软件对实验结果进行分析:与成年人、胎儿小脑相比，老年人小脑蛋白 质的双向电泳凝胶图谱上有5个蛋白质点上调，8个蛋白质点下调。通 过质谱鉴定，在老年人小脑中，谷氨酸脱氮酶、肌酸激酶前体、胶质纤 维酸性蛋白、Mn超氧化物歧化酶、a一烯醉化酶表达上调.而碳酸脱水 酶、二氮喻吮酶相关蛋白2、果糖二磷酸醛缩酶人、丙酮酸激酶、谷氮酞 胺合成酶、血红蛋白表达下调. 111人小脑与领叶的比较蛋白质组学分析 取4例老年人脑及1例中年人脑，将其额叶及小脑蛋白用双向电泳 进行展示.3个蛋白质在小脑表达量增加，被分别鉴定为杭氧化蛋白2、 肌酸激酶前体(线拉体)、果糖二磷酸醛缩酶C.另外5个蛋白质点在额 叶表达童增加.我们还鉴定了30个表达量在额叶及小脑没有显著变化的 蛋白质.这些被鉴定的蛋白质包括一些重要的酶类和调节蛋白质如超氧 化物歧化酶、硫氧还蛋白过氧化物酶、乌头酸水化酶、乌头酸酶2、3- 磷酸甘油醛脱氢酶、co f 1 1 in、肤酞-脯氨酞一顺反异构酶A、血清白蛋白 前体、二氢啥吮酶相关蛋白2、a一烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、苹果 4 博士学位论文 摘要 酸脱氮酶等.进一步丰富了人脑蛋白质组数据库。 w领濒叶痴呆的蛋白质组研究 选取5例经病理证实的额濒叶痴呆患者与4例正常老年人尸检脑标 本进行比较蛋白质组学研究.18种蛋白质的表达量在额濒叶痴呆患者与 正常老年人显著不同.12个在额濒叶痴呆表达量上调的蛋白质被鉴定为 3一磷酸甘油醛脱氮酶、尿喀吮DNA糖普水解酶、Cu一Zn超氧化物歧化酶、 异柠稼酸脱氮酶亚单位、5 ynaptotagminl、peroxiredoxinZ、胶质纤 维酸性蛋白、P25 a1Pha、烯酸辅酶A水合酶短链1、咄哆醉一5，-磷酸氧 化酶、Mn超氧化物歧化酶、a一烯醇化酶;6个在额颜叶痴呆表达量下调 的蛋白质被鉴定为杭氧化蛋白2(酸性钙离子依赖型磷脂酶A)、铁蛋白 H链、谷氛酸脱氮酶、肤基脯氛酸顺反异构酶A、血清白蛋白前体、二氢 喻吮酶相关蛋白2. V蛋白质组技术鉴定氧化修饰蛋白质 氧化修饰蛋白质在脑老化及变性性痴呆的发病机制中起主要作用. 本研究旨在建立以双向电泳结合we 5 ternblotting及质谱技术分离、鉴 定人脑氧化修饰蛋白质的方法.第一向等电聚焦后，IPG胶条同二稍基 苯拼(洲PH)反应，然后行第二向SDs一AGE电泳.两张平行凝胶中的一 张行考马斯亮兰染色，另一张凝胶上蛋白质点电转移至PvDF膜，PvDF 膜同抗一DNP杭体反应，HRP二抗标记，DAB显色.同PvDF膜上显色点相 对应的考染凝胶上的蛋白质点即为氧化修饰蛋白质.以质谱鉴定了两个 氧化修饰蛋白质一p-肌动蛋白和天冬氨酸氨基转移酶. 研究结论以蛋白质组学技术新发现了一?
【学位授予单位】：中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R749.16
【图文】：

理论分子量、等电点、Swiss一Prot数据库序列号、蛋白质鉴定分数以及肤段覆盖率等信息见表1.图1的1号蛋白点经胰蛋白酶胶内酶切，在MALDI一TOF质谱仪上得到的特征性的多肤质量谱及利用Mas。ot公司提供的免费的肤质量指纹图谱检索软件鉴定为杭氧化蛋白2的过程见图2(人一C).1号蛋白点以MALDI一TOF/TOF串联质谱技术被鉴定为抗氧化蛋白2的过程见图3(A一D):首先在第1级质谱得到肤片段质量指纹图谱，选择其中质量电荷比(m/z)为1200.75的肤段经离子化后进入第2级质谱分析仪，分析出该肤段的氨基酸序列为vvlsLQI江AEK。肤质童指纹图谱与肤序列信息一起用来检索蛋白质数据库，鉴定出蛋白质.图1的28号蛋白点被鉴定为胶质纤维酸性蛋白的过程见图4、图5.

图3MALDI一TOF/TOF串联质谱仪鉴定1号蛋白点为杭氧化蛋白2的过权Fig3.Ideniificationofspotlas“Antio石d别吐protein2’’byta口demMSanddati山。义se即陷hing.A.l级质谱分析仪得到的经胶内酶切的l号蛋白点肚质量指纹谱A.MLALDI.TOFMSPePtidemassfingerprintsPectl”mobtainedfromcrudepepti(l。mix奴ireafterin-geltryPtiedigestofsPotNo.lB.2级质谱分析仪对m龙】200.75肚段的分析B.LiftMsMsspectrUmofPrecursorionatn口之1200·75obtainedduringtheanaly“l”ofsPot1inAC.推导出氨基酸序列VVISLQLI’AEKC.Theaminoacid父quenceofVVISLQIJ人EKwasdedueed.D.被鉴定为抗氧化蛋白2，标下划线者为匹配肤段.D.TheProteinwasidentifiedas‘，AniioxidantProteinZ，，.MatchedpePti，~··、、’shownunderiined.

图SM^Lnl一TOF/TOF串联质谱仪对28号蛋白点m/21277.74KDa肤段氨基酸序列分析

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 何大澄,肖雪媛;差异蛋白质组学及其应用[J];北京师范大学学报(自然科学版);2002年04期

本文编号：2743430