粪菌移植对阿尔茨海默病小鼠的影响及分子机制研究

发布时间：2020-07-12 02:55

【摘要】：背景阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD),一种神经退行性疾病,是威胁人类健康的重大疾病之一。近些年来,虽然AD的发病机制和治疗方法取得了一定的研究进展,目前尚无有效治疗方法。随着微生态学发展,研究发现肠道菌群是和机体协同进化的微生物群体,它的改变会影响宿主健康,宿主菌群与寄主是互利共生的关系,被称为“超级有机体”。肠道微生物在宿主肠道与中枢神经系统的互相应答反应中发挥着重要作用,故此提出脑肠轴理论。很多神经系统疾病和精神疾病都存在微生物组群的变化,因此我们可以通过改变肠道微生物的组成,寻求治疗神经退行性疾病的新策略。研究发现益生菌、益生元对神经性疾病的调节和治疗效果在病情前期有较好的效果。粪菌移植(Fecal microbiota transplantation,FMT)可以调节肠道微生物的群落结构。本研究在对正常小鼠和AD小鼠的肠道微生物差异分析的基础上,以正常小鼠为供体对AD小鼠进行粪菌移植,检测粪菌移植能否缓解AD小鼠的病理特征,提高学习记忆能力,并探讨其潜在的分子机制。目的本课题通过16SrDNA高通量测序分析野生型小鼠和AD小鼠肠道微生物差异,利用粪菌移植的方法研究肠道微生物的改变对AD小鼠的影响,以期以肠道微生物为切入点,为AD的诊断、预防和治疗提供新的思路和方法。方法第一部分:正常小鼠和AD小鼠肠道微生物的差异分析野生型(wide type,WT)小鼠为WT组(n=5);APP695V717I转基因小鼠,为App~+组(n=5)。收集各组每小鼠粪便进行,采用高通量测序分析AD鼠与正常小鼠之间的物种组成和群落结构差异。第二部分:粪菌移植对AD小鼠的影响1.动物分组及粪菌移植:APP695V717I转基因AD小鼠的鉴定、饲养,随机选取15只,分为App~-组(n=5)、App~+组(n=5)、3月龄AD小鼠粪菌移植组(FMT)(n=5),对FMT组小鼠粪菌移植干预4周,期间每周测量小鼠体重变化情况,干预结束后,各组小鼠进行Morris水迷宫实验。2.粪菌移植后AD鼠肠道菌群的变化:无菌环境下收集野生组小鼠、AD组、粪菌移植组三组小鼠粪便,使用HiSeq2500 PE250进行上机测序,分析粪菌移植后AD鼠肠道微生物物种组成和群落结构差异。3.粪菌移植对AD鼠治疗作用的分子机制:刚果红染色法观察小鼠脑内β淀粉样蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)沉积的变化情况;免疫荧光检测小鼠海马组织APP蛋白的表达情况;Western Blot和RT-PCR检测衰老相关蛋白(p16、p21、p53、sirt1、sirt2、pcna)、和炎性因子(IL-10、IL-1β,TNF-α)、神经营养因子(NT3、BDNF、NGF)以及APP蛋白在蛋白水平及基因水平表达量的变化;ELISA检测血清SOD活性、MDA含量。结果第一部分正常小鼠和AD小鼠肠道微生物的差异分析测序结果显示,与正常小鼠相比,AD鼠肠道菌群多样性降低,在各分类水平上的相对丰度存在差异。LEfSe分析结果表明在微生物各分类水平上WT组和AD组中有差异显著的Biomarker。具体表现在:Bacteroidales group、Ruminococcus、Firmicutes bacterium、Prevotellaceae4个类群是WT组中特异的微生物物种;Verrucomicrobiaceae、Akkermansia、Peptostreptococcaceae、Romboutsia、Lactobacillus animalis、Lactobacillales、Bacilli是AD小鼠中特异的微生物物种。第二部分粪菌移植对AD小鼠的影响1.门水平上,FMT组较AD组中Firmicutes相对丰度较少显著增高,接近WT组;在纲水平上,与AD组相比,FMT组中Erysipelotrichia、Clostridia、Bacteroidia相对丰度增加,而Verrucomicrobia、Clostridia、Bacteroidia相对丰度降低;目水平上,FMT组Bacteroidales显著降低;科水平上FMT组中Erysipelotrichaceae丰度显著增加;属水平上,粪菌移植后AD鼠肠道内Allobaculum增加,而Ruminococcus显著减少,WT组没有Romboutsia,FMT组Romboutsia的相对丰度几乎为零,然而在AD组却见一定丰度的Romboutsia;种水平上,FMT组中Lactobacillus-animalis几乎降低为零。2.与App~+组小鼠相比,FMT组小鼠在行为学方面表现为学习记忆能力增强(P0.05)。3.粪菌移植后AD鼠血清中SOD活性增高、而海马组织中抑炎性因子IL-10相对表达量增高、促炎因子IL-1β,TNFα等相对表达水平降低(P0.05)、衰老相关蛋白及基因p16、p21等的相对表达量降低(P0.05)、神经营养因子BDNF、NT3、NGF等的相对表达量增高(P0.05)、APP蛋白相对表达量及Aβ淀粉样蛋白沉积减少(P0.05)。结论1.与野生型小鼠相比,AD小鼠肠道微生物多样性降低,物种丰度也存在显著差异。2.粪菌移植使AD小鼠肠道微生物在各分类水平物种丰度更趋向于WT组。粪菌移植使AD小鼠在行为学方面的认知功能得到改善,抗氧化损伤能力提高,减轻炎性反应水平,促进神经元的发育、存活,减少Aβ淀粉样蛋白沉积,在一定程度上缓解了阿尔茨海默病病理特征。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R749.16
【图文】：

电泳图,转基因小鼠,电泳图,数目

图 1.1 APP 转基因小鼠 PCR 产物电泳图据统计处理及 OTU 聚类结果 1.2 可以直观的看到每个样品 Tags 数目及 OTU 数目，我们两组样品的平均 Effective Tags 数分别是：68648、68947；579。

电泳图,聚类,情况,数目

在 284bp 处显示有阳性条带，为 APP 转基因阳性小鼠。图 1.1 APP 转基因小鼠 PCR 产物电泳图1.2.2 数据统计处理及 OTU 聚类结果从图 1.2 可以直观的看到每个样品 Tags 数目及 OTU 数目，我们可以计算出WT、AD 两组样品的平均 Effective Tags 数分别是：68648、68947； OTU 数目是：602、579。图 1.2 各样品的 OTUs 聚类和注释情况统计说明：横坐标是样品名；第一纵坐标(Tags Number)是 Tags 数目；第二纵坐标(OTUs Number)是 OTUs 的数目。

物种,丰度

9图 1.3 各分类水平（Phylum、Class、Order、Family、Genus、Species）上最大丰度前 10 的物种（A、B、C、D、E、F 分别是对应 Phylum、Class、Order、Family、Genpecies）.2.4 Alpha 多样性分析Alpha 多样性反映了各组肠道中的物种丰富度以及差异性。指数越高，物样性越高；数值越大，物种越多。WT 组、AD 两组可检测到的物种数为 4632，WT 组的各种 Alpha 多样性指数比 AD 组大，即 WT 组内物种多样性好D 组。

【参考文献】