【摘要】：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)和糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是常见的、危害中老年人健康和生命安全的两种疾病。近年来的流行病学调查显示AD和DM之间存在显著关联。研究显示,DM患者AD的发生率较正常人群高出2-5倍。相应的,AD患者也有DM的高发风险。糖代谢紊乱,增加了认知功能损害或者痴呆发生,尤其是老年痴呆的主要类型--AD的高发危险因素。此外,AD患者脑细胞葡萄糖与能量代谢显著降低、而且明显早于临床症候和特征性病理损害的形成。动物实验研究也提示脑细胞葡萄糖代谢异常可能是AD病理生理发生的关键因素。因而,AD有“Ⅲ型糖尿病”或“脑胰岛素抵抗”之称。但是到目前为止,糖代谢紊乱诱发或加重阿尔茨海默病病理损害的具体机制尚未明了。 AD是一种中枢神经系统退行性疾病,临床上以进行性的认知功能损伤和特征性的病理学改变为主要特征。AD的病理学特征包括脑细胞内神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)和细胞外老年斑(senile plaques,SP)形成。SP主要是由β-淀粉样多肽(β-amyloid peptide, Aβ)的沉积形成,Aβ是其前体蛋白APP裂解的小分子片段,分子量为4kDa左右。Aβ具有神经元毒性,Aβ沉积和随后的老年斑形成被认为是AD发生的最主要的原因。糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3)是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是参与糖代谢的主要限速酶之一。GSK-3在脑中高表达,除了参与糖代谢外,还与很多生理病理学过程相关。有趣的是,近年来的研究发现,GSK-3也是参与AD发病过程的重要因素。有人通过对APP过表达的AD模型鼠的研究证实,抑制GSK-3的活性可以有效减少Aβ的产生和沉积。我们课题组先前用苯磷硫胺对APP/PS1双转基因动物模型进行干预研究,结果发现苯磷硫胺能够明显提高GSK-3的磷酸化水平,降低GSK-3α和GSK-3β的活性,减轻AD病理损害及改善行为学表现。这里,我们利用HEK293APPsw过表达细胞系,探讨高糖环境是否能够增加Aβ的产生,以及苯磷硫胺体外干预是否也通过抑制GSK-3活性来减少Aβ产生。 第一部分：高糖加剧HEK293APPsw过表达细胞β-淀粉样多肽产生 一、不同糖浓度对HEK293细胞及HEK293APPsw过表达细胞β-淀粉样多肽产生的影响 目的：研究不同糖浓度对HEK293APPsw过表达细胞及HEK293细胞产生Aβ的影响。 方法：选取人胚肾细胞(HEK293)及APP过表达的人胚肾细胞(HEK293APPsw过表达细胞)为实验细胞,不同糖浓度培养基培养作为实验条件。使用含不同葡萄糖浓度的培养液(终浓度分别为lg/L、3g/L、4.5g/L、5.5g/L、6.5g/L、7.5g/L、8.5g/L、10.5g/L)培养HEK293APPsw过表达细胞,并分别取培养不同时间点(6、12、24h)上清液,进行ELISA法检测不同糖浓度、不同时间点Aβ产生情用1g/L、5.5g/L糖浓度的培养液培养HEK293APPsw过表达细胞及人胚肾细胞(HEK293细胞)12h,收取上清液进行ELISA法检测,对比不同细胞系Aβ产生情况。 结果：HEK293APPsw过表达细胞较其载体细胞HEK293细胞Aβ产生明显增多,验证了细胞株的成功转染。 随着细胞培养液中葡萄糖浓度的增加,HEK293APPsw过表达细胞Aβ产生量呈现先增加后减少的特点,葡萄糖浓度为5.5g/L培养液在12小时培养后Aβ产生到达最高峰。统计学数据显示,培养液中糖浓度在5.5g/L与lg/L时,HEK293APPsw过表达细胞Aβ产生量在6和12小时培养后有显著的统计学差异,6小时时间点p0.05,12小时时间点Aβ产生量达到高峰,P0.01,而在培养24小时后Aβ产生量不具有统计学差异。 不同糖浓度(1g/L与5.5g/L)对HEK293细胞Aβ产生没有影响(P0.05)。 结论：HEK293APPsw过表达细胞较其载体细胞HEK293细胞Aβ产生明显增多,验证了细胞株的成功转染。不同糖浓度的培养基培养对HEK293APPsw过表达细胞产生Aβ有显著影响,呈现先增高、后降低的特点：5.5g/L糖浓度DMEM在12小时培养后较1g/L糖浓度DMEM在12小时培养后Aβ产生明显增加,最具有统计学差异。而不同糖浓度对HEK293细胞没有影响。 二、高糖对HEK293APPsw过表达细胞增殖与毒性的影响 目的：研究不同糖浓度对HEK293APPsw过表达细胞增值及毒性作用。 方法：选取HEK293APPsw过表达细胞为实验细胞,不同糖浓度培养基培养作为实验条件。在不同葡萄糖浓度的培养液(终浓度分别为1g/L、3g/L、4.5g/L、5.5g/L)培养HEK293APPsw过表达细胞,取12h上清液,尔后应用CCK-8试验检测细胞的活性。 结果：随着细胞培养液中葡萄糖浓度的增加(1g/L、3g/L、4.5g/L、5.5g/L),HEK293APPsw细胞Aβ产生量呈现增加趋势,但是生长抑制率无明显增加趋势,P0.05,不具有统计学差异。也就是说糖浓度在一定范围内增加(1g/L、3g/L、4.5g/L、5.5g/L)对HEK293APPsw过表达细胞不具有毒性作用。 结论：不同糖浓度的DMEM培养基(葡萄糖终浓度为1g/L、3g/L、4.5g/L、5.5g/L)培养HEK293APPsw过表达细胞12小时,对HEK293APPsw过表达细胞活性影响不具有统计学差异。综上,构建理想的HEK293APPsw过表达细胞培养条件,为后续的实验研究奠定了基础。 第二部分：苯磷硫胺减少HEK293APPsw过表达细胞β-淀粉样多肽产生 目的：观察苯磷硫胺是否减少HEK293APPsw过表达细胞Aβ产生。 方法：基于上述研究,HEK293APPsw细胞葡萄糖浓度为5.5g/LDMEM培养基,培养时间为12小时Aβ产生量最多。因此取HEK293APPsw过表达细胞,随机分为4组：(1)对照组(Con),细胞不经过药物处理,仅在含葡萄糖5.5g/L培养液中加入苯磷硫胺配制液培养12小时；(2)苯磷硫胺10μ g/ml组(BT10),在含糖为5.5g/L培养液中加入苯磷硫胺,使其终浓度为10μ g/ml,培养12小时；(3)苯磷硫胺20μ g/ml组(BT20),在含糖为5.5g/L培养液中加入苯磷硫胺,使其终浓度为20μ g/m1,培养12小时；(4)苯磷硫胺40μ g/ml组(BT40),在含糖为5.5g/L培养液中加入苯磷硫胺,使其终浓度为40μ g/m1,培养12小时;应用ELISA检测试剂盒检测不同药物浓度对Aβ产生的影响。 结果：苯磷硫胺20μ g/m1组和40μ g/ml组均能显著减少Aβ产生。与对照组相比,40μ g/ml组P0.01,20μ g/ml组P0.05；苯磷硫胺10μ g/ml组,有使Aβ产生减少的趋势,但与对照组(Con)相比,不具有显著的统计学差异性。结论：苯磷硫胺显著减少HEK293APPsw过表达细胞Aβ产生,一定范围内随着药物剂量的增加抑制作用也随之增加。 第三部分：高糖增加β-淀粉样蛋白产生和苯磷硫胺干预与调制糖合酶激酶-3活性的机制研究 目的：研究高糖增加HEK293APPsw过表达细胞Aβ产生及苯磷硫胺减少HEK293APPsw过表达细胞Aβ产生与GSK-3活性的相关性。 方法：选取HEK293APPsw过表达细胞为实验细胞,随机分为3组：(1)低糖对照组,含葡萄糖1g/L的培养基加入苯磷硫胺配制液培养HEK293APPsw过表达细胞12小时；(2)高糖对照组,含葡萄糖5.5g/L的培养基加入苯磷硫胺配制液培养HEK293APPsw过表达细胞12小时；(3)BT40组,在含糖为5.5g/L培养液中加入苯磷硫胺,使其终浓度为40μ g/ml,培养12小时。收集细胞提取蛋白,Western blot检测p-GSK-3α,GSK-3α,p-GSK-3β,GSK-3β表达量,比较各组间p-GSK-3α/GSK-3α, p-GSK-3β/GSK-3β比值变化,并采用酶活性检测试剂盒检测GSK-3α和GSK-3β的活性,比较各组间酶活性变化。 结果:Western blot结果示高糖对照组较低糖对照组p-GSK-3α/GSK-3α比值减少,有显著的统计学差异(P0.01),高糖对照组较低糖对照组p-GSK-3β/GSK-3β比值减少,有统计学差异(P0.05),但是BT40组较高糖对照组p-GSK-3α/GSK-3α比值,及p-GSK-3β/GSK-3β比值有增加趋势,但是没有统计学差异。酶活结果示高糖对照组较低糖对照组GSK-3α、GSK-3β活性增加,有显著的统计学差异(P0.05),BT40组较高糖对照组GSK-3α、GSK-3β活性均降低,有明显的统计学差异(P0.05)。 结论：高糖对照组较低糖对照组GSK-3α、GSK-3β活性增加,p-GSK-3α/GSK-3α、 p-GSK-3β/GSK-3β比值显著降低,表明GSK-3可能参与高糖加重HEK293APPsw过表达细胞Aβ产生的机制,BT40组较对照组GSK-3α、GSK-3β活性均降低,表明苯磷硫胺能够减少HEK293APPsw过表达细胞Aβ产生可能和GSK-3的活性相关。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R749.16;R587.1
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