高级糖基化终末产物促进巨噬细胞迁移抑制因子介导神经炎症在阿尔茨海默病中的机制研究

发布时间：2020-07-13 14:58

【摘要】：研究背景:高级糖基化终末产物(AGEs)是糖尿病的重要致病物质,并且在阿尔茨海默病(AD)的发生和发展中也起着重要的推进作用。它可以促进微管相关蛋白Tau蛋白的过度磷酸化和β-淀粉样蛋白(Aβ)的沉积。而糖尿病中另一致病因子巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)也被发现相对于同龄正常患者在AD患者和轻度认识障碍(MCI)患者的脑脊液中会显著增高。MIF的缺失也可以减弱Tau蛋白的过度磷酸化。研究目的:1.AGEs对MIF的影响研究及分子机制研究。2.MIF抑制剂ISO-1在AGEs进一步损伤AD细胞模型的保护作用研究。研究方法:1.体外培养PC12细胞,用AGEs处理PC12细胞,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及免疫印迹法(Western Blot,WB)检测细胞中MIF的mRNA和蛋白表达,设空白对照组和BSA对照组。2.体外培养PC12细胞,AGEs处理PC12细胞,分别加入?基因结合核因子(nuclear factor-k-gene binding,NF-?B)抑制剂、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)抑制剂、磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3 kinase,PI3K)抑制剂、磷脂酶C(phospholipase C,PLC)抑制剂、高级糖基化终末产物受体(the receptor of advanced glycation endproducts,RAGE)抑制剂,qRT-PCR法检测细胞中MIF的mRNA表达,设空白对照组和AEGs对照组。3.MTT法筛选Aβ_(1-40)的最适浓度和最佳给药时间,建立AD细胞模型。CCK-8法筛选AGEs最适浓度。AGEs和ISO-1作用于Aβ_(1-40)诱导的PC12细胞,倒置显微镜下观察细胞数目和形态,qRT-PCR法检测白介素1β(interleukin 1beta,IL-1β)、白介素6(interleukin 6,IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)的mRNA表达。研究结果:1.BSA作为对照组和空白对照组并没有显著差异。而与空白对照组相比,AGEs浓度200μg/ml、300μg/ml两组具有统计学差异(P0.05),MIF mRNA表达有明显升高。AGEs浓度100μg/ml、300μg/ml两组具有统计学差异(P0.05),MIF蛋白表达有明显升高。2.与AEGs对照组相比较,加入NF-kB抑制剂、MAPK抑制剂、RAGE抑制剂、PLC抑制剂后MIF的mRNA表达分别有不同程度下降(P0.05)。3.倒置显微镜100×下可见正常对照组PC12细胞树突多而长,紧贴瓶底,细胞密集,结构清晰且核仁可见,细胞增殖快。与对照组相比Aβ_(1-40)造模组细胞增殖受到抑制,细胞数减少,细胞间连接松弛且部分树突缩回,核仁部分可见。经过AGEs处理细胞后,细胞增殖进一步受到抑制,大量细胞浮起变圆,细胞碎片较多。贴壁细胞失去正常神经细胞特征。而先经过ISO-1预处理后可见细胞增殖的抑制作用显著减弱,细胞数目增多,漂浮细胞减少且贴壁细胞形态良好,细胞间连接增多,树突变长变多。AGEs促进了Aβ_(1-40)诱导的PC12细胞构建的AD模型细胞的损伤和凋亡以及炎症介质IL-1β、IL-6和TNF-α的表达,AGEs和ISO-1共同作用可明显提高AD细胞模型的细胞生存率、下调炎症介质的表达水平(P0.05)。研究结论:1.AGEs促进细胞模型MIF的表达。2.AGEs促进MIF表达的分子学机制可能是通过NF-kB信号通路、MAPK信号通路、PI3K信号通路、PLC信号通路来实现的。3.ISO-1降低了AGEs对AD细胞模型的损伤作用,其机制可能是AGEs介导MIF表达促进AD细胞模型的神经炎症,而ISO-1降低了其神经炎症介质的表达。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R749.16
【图文】：

后提取,蛋白表达,表达水平,蛋白

图 2.1AGEs 对 MIF mRNA 表达的影响The effect ofAGEs on the expression of MIF mRNA不同浓度 AGEs 处理 PC12 细胞，测得 MIF mRNA 相对表达水平，显示的表达。数据以x±S 表示，n=3，**P<0.01 and *P<0.05。2.3.2AGEs 对 MIF 的蛋白表达的影响为了探讨 AGEs 是否影响 MIF 蛋白的表达，用不同浓度24 小时后提取蛋白检测 MIF 蛋白的表达水平。结果显示，与浓为 100μg/ml、300μg/ml 两组具有统计学差异，MIF 蛋白表2.2)。表明 AGEs 可以促进 MIF 蛋白的表达。AMIFGAPDH

蛋白表达,糖尿病,胰高血糖素样肽,小鼠

图 2.2AGEs 对 MIF 蛋白表达的影响Effect ofAGEs on the expression of MIF prote不同浓度 AGEs 处理 PC12 细胞，测得 MIF 蛋白的相对表达水平，的表达。数据以x±S 表示，n=3，**P<0.01 and *P<0.05。2.4 讨论近年来研究发现，糖尿病通过引起胰岛素信号转导通生，而胰岛素抵抗和 2 型糖尿病可能与 AD 的高发病率具主要影响执行能力和学习记忆能力，其损害程度较 1 型糖尿病时间越长以及血糖控制不稳定，其认知功能减退越明及新型长效胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide1, GLP-患者的认知功能[30]。一项关于糖尿病伴 AD 小鼠的研究发鼠，糖尿病伴 AD 小鼠的 Tau 蛋白和 Aβ的积累增加。表明

最适浓度

高级糖基化终末产物促进巨噬细胞迁移抑制因子表达介导神经炎症在阿尔计量资料数据以(x±S)表示。3.3 实验结果3.3.1AGEs 处理 PC12 细胞的最适浓度与对照组相比，随着 AGEs 浓度的增加，细胞的存活细胞状态，AGEs 100μg/ml、200μg/ml 浓度时细胞贴壁良300μg/ml 浓度时有部分细胞悬浮，状态欠佳，400μg/ml 浓浮。经 GraphPad Prism 5 软件计算出 AGEs 处理细胞(concentration for 50% of maximal effect, EC50) 为 335.0μg用 AGEs 处理细胞的浓度为 300μg/ml。

【参考文献】