miR-21介导的人羊膜间充质干细胞对阿尔兹海默病鼠脑内炎症因子表达的影响

发布时间：2020-07-15 13:25

【摘要】：阿尔兹海默病(alzheimer’s disease,AD),又称为老年痴呆症。AD是致死性神经退行性疾病,主要表现为认知障碍和记忆能力下降。随着人类老龄化的不断发展,AD的发病率也逐年升高。AD的病因较为复杂,且AD的发病机理目前还尚不明确,因此迄今为止还没有确切的治疗方法。在最近几年的研究中,有利用神经干细胞移植来改善AD病鼠的记忆能力。但神经干细胞来源有限,大多来自胚胎组织,而且还有社会伦理之争。人羊膜间充质干细胞(human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells,hAM-MSCs),是从新生儿的胎盘上分离培养的干细胞,作为医疗废弃物,其来源广泛、免疫原性低、安全可靠,且无医学伦理之争。有研究将其用于治疗创伤性脑损伤,发现hAM-MSCs能够促进神经功能的恢复。有研究将hAM-MSCs移植至阿尔兹海默病鼠中,发现小鼠的学习和记忆能力有增强的趋势,可见其有缓解AD病患者症状的潜能。研究发现,人间充质干细胞具有调节多种免疫细胞的功能,例如:T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等,进而可以调节免疫反应。据研究,人间充质干细胞在造血干细胞移植导致的移植物抗宿主病以及自身免疫系统疾病方面具有良好的治疗效果。小分子核糖核酸(miRNA)是一类小的非编码RNA,可以通过结合靶基因的3'UTR特定位点控制基因表达,导致转录抑制或退化。miRNA在细胞分化、增殖和凋亡等过程中具有重要的调节功能。有研究发现miR-21可以靶向抑制TGFBR2的表达,进而调节TGF信号在人脂肪组织提取干细胞(human Adiposederived Stem Cells,hASCs)细胞分化中的作用。最近,miRNA被报道为神经退行性疾病和影响中枢神经系统的生物标记物,且发现血清miRNA有作为AD的诊断生物标志物的潜在作用。研究发现miR-21是一种重要的神经转录因子,其高表达有助于神经功能障碍恢复。但miR-21在阿尔兹海默病的作用和机制还未知晓。本课题主要目的是研究miR-21介导的hAM-MSCs对阿尔兹海默病的影响和可能的机制,首先以新生儿胎盘分离培养的hAM-MSCs作为研究材料,分析了miR-21在hAM-MSCs以及AD病鼠中的表达及意义,然后,构建miR-21过表达和干扰慢病毒载体及稳定转染的hAM-MSCs细胞,并探究了miR-21过表达和干扰对hAM-MSCs细胞增殖、凋亡、周期以及miR-21介导的hAM-MSCs对人外周血单个核细胞中TNF-α、MCP-1和IL-10表达的影响,最后,进一步利用APP转基因小鼠模型,体内研究了miR-21对hAM-MSCs在AD病鼠脑内归巢和存活的影响,利用水迷宫实验对miR-21对hAM-MSCs移植后AD病鼠的学习和记忆能力进行了检测,同时,检测了miR-21对hAM-MSCs移植AD病鼠海马组织中神经细胞标志抗原和炎症因子的表达情况。本研究主要分为三部分进行:第一部分:miR-21在人羊膜间充质干细胞以及AD病鼠中的表达及意义研究;第二部分:miR-21对hAM-MSCs生物学特性以及免疫调节作用的影响研究;第三部分:miR-21对hAM-MSCs在AD病鼠脑内迁移以及炎症因子表达的影响研究。主要内容:第一部分miR-21在人羊膜间充质干细胞以及AD病鼠中的表达及意义研究方法1.从新生儿胎盘羊膜中分离培养人羊膜间充质干细胞hAM-MSCs。2.用流式细胞仪分析hAM-MSCs细胞表面标记,用免疫荧光检测表面抗原Vimentin和SSEA-4,以鉴定hAM-MSCs细胞。3.qRT-PCR检测miR-21在人羊膜上皮细胞与hAM-MSCs中的表达情况。4.qRT-PCR检测miR-21在正常小鼠与AD病鼠海马组织中的表达。结果1.对第3代hAM-MSCs进行流式细胞术检测分析,发现hAM-MSCs中CD29、CD44、CD73、CD90阳性表达率分别为97.3%、96.3%、97.8%、98.2%,而CD34、CD45表达仅0.6%、0.84%。对hAM-MSCs细胞进行免疫荧光染色检测发现Vimentin和SSEA-4两种细胞表面抗原均在hAM-MSCs细胞质中阳性表达。结果表明,成功分离到纯度较高的具有间充质干细胞特点的hAM-MSCs。2.qRT-PCR检测结果发现,miR-21在hAM-MSCs中的表达量明显高于羊膜上皮细胞,且miR-21在AD病鼠海马组织中的表达量明显低于正常鼠。第二部分miR-21对hAM-MSCs生物学特性以及免疫调节作用的影响研究方法1.构建miR-21过表达慢病毒载体:将miR-21和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro连接,构建miR-21过表达慢病毒载体pLent-miR-21,菌落PCR鉴定,并送公司测序。2.miR-21干扰慢病毒载体:将anti-miR-21和pLent-hU6-GFP-Puro连接,构建miR-21干扰慢病毒载体pLent-anti-miR-21,菌落PCR鉴定,并送公司测序。3.对重组慢病毒载体进行病毒包装,滴度测定重组慢病毒的滴度值。4.LV-miR-21和LV-anti-miR-21分别感染hAM-MSCs,得到稳定细胞系hAM-MSCs-miR-21和hAM-MSCs-anti-miR-21。5.qRT-PCR检测hAM-MSCs、hAM-MSCs-miR-21和hAM-MSCs-anti-miR-21细胞中miR-21的表达水平。6.CCK-8实验检测miR-21对hAM-MSCs细胞增殖的影响。7.流式细胞术检测miR-21对hAM-MSCs细胞周期的影响。8.流式细胞术检测miR-21对hAM-MSCs细胞凋亡的影响。9.ELISA检测hAM-MSCs与人外周血单个核细胞共培养上清中TNF-α、MCP-1和IL-10的含量。结果1.pLent-miR-21和pLent-anti-miR-21慢病毒载体菌落PCR和测序结果显示,其分子大小及序列与NCBI中的参考序列一致。表明pLent-miR-21和pLent-anti-miR-21慢病毒载体构建成功。2.经测定LV-miR-21、LV-anti-miR-21病毒滴定值为2×10~8 TU/mL。用LV-miR-21,LV-anti-miR-21感染hAM-MSCs,观察荧光结果发现,大部分细胞有绿色荧光表现,说明病毒感染效率较高。3.与hAM-MSCs组相比,hAM-MSCs-miR-21组miR-21表达量明显升高,而hAM-MSCs-anti-miR-21组miR-21明显降低,说明我们成功构建了miR-21过表达和干扰细胞系。4.CCK-8实验检测发现miR-21过表达显著促进hAM-MSCs细胞的增殖,而miR-21干扰则抑制hAM-MSCs细胞的增殖。5.流式细胞术检测发现与hAM-MSCs对照组相比,miR-21过表达后S期细胞比例明显增多,miR-21表达受干扰后S期细胞比例明显减少。6.流式细胞术检测发现miR-21过表达明显抑制hAM-MSCs的凋亡,而miR-21干扰明显促进hAM-MSCs的凋亡。7.ELISA检测发现,与人外周血单个核细胞相比,hAM-MSCs与人外周血单个核细胞共培养后,hAM-MSCs明显抑制人外周血单个核细胞对TNF-α、MCP-1的分泌,促进对IL-10的分泌;与hAM-MSCs与人外周血单个核细胞共培养组相比,miR-21过表达后明显增强hAM-MSCs对人外周血单个核细胞分泌TNF-α、MCP-1的抑制作用,及人外周血单个核细胞分泌IL-10的促进作用,而miR-21表达受干扰后明显抑制hAM-MSCs对人外周血单个核细胞分泌TNF-α、MCP-1的抑制作用,及人外周血单个核细胞分泌IL-10的促进作用。第三部分miR-21对hAM-MSCs在AD病鼠脑内迁移以及炎症因子表达的影响研究方法1.对实验所用的APP转基因鼠进行PCR鉴定。2.对AD病鼠进行hAM-MSCs尾静脉移植,并用荧光检测静脉移植后hAM-MSCs在小鼠脑部的归巢和存活情况。3.Morris水迷宫:定位航行实验及空间探索实验检测各组AD病鼠的学习和记忆能力。4.免疫组化、qRT-PCR和Western blot检测AD病鼠海马组织内神经细胞标志抗原GFAP、Nestin和NSE的表达情况。5.Western blot检测AD病鼠海马组织中增殖(Ki67)及凋亡相关蛋白(Caspase-3、Bax、Bcl-2)的表达;并检测AD病鼠海马组中内TNF-α、MCP-1和IL-10的表达。结果1.通过尾静脉hAM-MSCs细胞移植后,与hAM-MSCs组相比,在AD病鼠脑部,hAM-MSCs中miR-21过表达后存活的荧光标记细胞数量明显增多,且荧光标记细胞随着时间延长先增加后减少,而干扰miR-21表达后荧光标记细胞数目明显减少,且存活时间较短。可见miR-21过表达可促进hAM-MSCs在AD病鼠脑内的归巢和存活。2.与生理盐水组相比,hAM-MSCs尾静脉移植的AD病鼠穿越平台次数明显增加,平台象限停留时间百分比明显升高,逃避潜伏期时间明显缩短。另外,与hAM-MSCs组相比,miR-21过表达后经hAM-MSCs尾静脉移植的AD病鼠穿越平台次数明显增加,平台象限停留时间百分比明显升高,逃避潜伏期时间明显缩短;miR-21表达受干扰后小鼠穿越平台次数明显减少,平台象限停留时间百分比明显降低,逃避潜伏期明显增长。说明miR-21过表达能够促进hAM-MSCs尾静脉移植有效改善AD病鼠的学习和记忆能力,对具有AD症状的小鼠有治疗作用。3.与生理盐水组相比,hAM-MSCs尾静脉移植的AD病鼠海马组织中,Ki67和Bcl-2的表达量明显升高,而Caspase-3和Bax的表达量明显降低。另外,经hAM-MSCs尾静脉移植的AD病鼠海马组织中,miR-21过表达后Ki67和Bcl-2的表达量明显升高,而Caspase-3和Bax的表达量明显降低;miR-21表达受干扰后Ki67和Bcl-2的表达量明显降低,而Caspase-3和Bax的表达量明显升高。4.免疫组化、qRT-PCR和Western blot结果显示,与生理盐水组相比,hAM-MSCs尾静脉移植的AD病鼠海马组织中,神经细胞标志抗原GFAP、Nestin和NSE的表达明显增加。另外,经hAM-MSCs尾静脉移植的AD病鼠海马组织中,miR-21过表达促进神经细胞标志抗原GFAP、Nestin和NSE的表达;而miR-21表达受干扰后,小鼠海马组织内GFAP、Nestin和NSE的表达量明显降低。5.与生理盐水组相比,hAM-MSCs尾静脉移植的AD病鼠海马组织中,促炎因子TNF-α、MCP-1的表达显著减少,而抑炎因子IL-10的表达显著增加。另外,经hAM-MSCs尾静脉移植的AD病鼠海马组织中,miR-21过表达显著抑制TNF-α、MCP-1的表达,促进IL-10的表达量。而miR-21表达受干扰后,小鼠海马组织内TNF-α和MCP-1的表达量明显升高,而IL-10的表达量明显降低。全文结论1.本研究分离获得了纯度较高的hAM-MSCs,miR-21在hAM-MSCs中的表达量明显高于人羊膜上皮细胞,而miR-21在AD病鼠海马组织中的表达量明显低于正常鼠。2.miR-21过表达显著促进hAM-MSCs细胞的增殖,抑制其凋亡,提高S期细胞比例,并增强hAM-MSCs对人外周血单个核细胞分泌TNF-α、MCP-1的抑制作用,及人外周血单个核细胞分泌IL-10的促进作用;而miR-21干扰则抑制hAM-MSCs细胞的增殖,促进其凋亡,降低S期细胞比例,并抑制hAM-MSCs对人外周血单个核细胞分泌TNF-α、MCP-1的抑制作用,及人外周血单个核细胞分泌IL-10的促进作用。3.动物体内研究结果表明,miR-21过表达增强hAM-MSCs尾静脉移植对AD病鼠海马组织中Ki67和Bcl-2表达的促进作用,及Caspase-3和Bax表达的抑制作用。miR-21过表达增强hAM-MSCs尾静脉移植对AD病鼠海马组织内神经细胞标志抗原GFAP、Nestin和NSE表达的促进作用,促进脑组织中神经损伤的修复和再生。另外,miR-21过表达能够增强hAM-MSCs尾静脉移植对AD病鼠海马组织内TNF-α和MCP-1表达的抑制作用,IL-10表达的促进作用,减轻局部炎症反应,减少神经元的损伤。miR-21干扰则有效抑制该效应。表明miR-21过表达的hAM-MSCs尾静脉移植能够有效改善AD病鼠的学习和记忆能力,对具有AD症状的小鼠有治疗作用。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R749.16
【图文】：

间充质干细胞,上清液

上下混匀，放置 10 min，12000 rpm 离心 10 min。4）弃上清液，加入 1 mL 的 75%乙醇，混匀，4℃下 12000 rpm 离心 5 5）弃上清液，干燥 10 min。用 30 mL DEPC 水将 RNA 溶解，保存于-8然后将提取的 RNA 反转录为 cDNA，进行 qRT-PCR。具体方法步骤同数据分析用 SPSS13.0 软件对数据进行分析，数据以均数±标准差（ x s）表示，进行方差分析和 t 检验。以 P < 0.05 为差异有显著性。结果人羊膜间充质干细胞 hAM-MSCs 的分离和培养于无菌条件下，从正常足月剖腹产胎儿的胎盘脐带面的羊膜中分M-MSCs 细胞，进行体外培养，结果如图 1-1 所示，hAM-MSCs 原代细胞（壁生长，呈长梭形。hAM-MSCs 细胞传至第 3 代（P3）时，形态为长梭长紧密，有伪足，排列整齐。

表面标志,表面抗原

图 1-2 hAM-MSCs 表面标志物的鉴定Figure 1-2 Identification of hAM-MSCs surface markers. 免疫荧光检测 hAM-MSCs 表面抗原 Vimentin 和 SSEA-4 的表达对第 3 代 hAM-MSCs 细胞进行免疫荧光染色检测细胞表面标记蛋mentin 和 SSEA-4 的表达。结果如图 1-3，DAPI 染色显示，hAM-MSCs 胞核被 DAPI 染成蓝色，且 Vimentin 和 SSEA-4 两种表面抗原蛋白M-MSCs 细胞质中阳性表达。

表面抗原,细胞表面标记,表面标志,性表达

图 1-2 hAM-MSCs 表面标志物的鉴定Figure 1-2 Identification of hAM-MSCs surface markers. 免疫荧光检测 hAM-MSCs 表面抗原 Vimentin 和 SSEA-4 的表达对第 3 代 hAM-MSCs 细胞进行免疫荧光染色检测细胞表面标记蛋mentin 和 SSEA-4 的表达。结果如图 1-3，DAPI 染色显示，hAM-MSCs 细胞核被 DAPI 染成蓝色，且 Vimentin 和 SSEA-4 两种表面抗原蛋白均M-MSCs 细胞质中阳性表达。

【参考文献】