精神分裂症患者外周血单个核细胞来源iPSCs模型的建立

发布时间：2020-07-20 21:34

【摘要】：背景精神分裂症(Schizophrenia,SZ)是一种神经系统受损的衰弱性精神疾病,具有神经递质功能障碍、前额皮质神经元异常分布等与神经元密切相关的病理特征。虽然大量的尸检数据、动物模型和成像模式为该病病理及生理研究提供了理论依据,但临床试验中仍然缺乏适当的疾病模型。iPS技术的出现为SZ的病理研究提供新的细胞疾病模型,为深入研究其发病机制和临床治疗提供基础。目的1.本文通过单因素比较获得高效率慢病毒包装所需细胞的最佳培养时间和接种密度,为iPSCs(Induced Pluripotent Stem Cells,i PSCs)重编程提供技术保障。2.将SZ患者的PBMCs(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMCs)通过慢病毒转染OKSM转录因子进行重编程,建立精神分裂症的iPSCs模型,并对该模型的核型以及炎症因子的表达进行分析检测。方法1.利用293T细胞,在接种相同密度的前提下,分别培养不同时间(19h、24h和29h)后进行病毒包装;在培养相同时间(24h)前提下,接种不同密度的293T细胞后包装病毒;通过对两个变量的比较获得高效率慢病毒包装所需细胞的最佳培养时间和接种密度。2.利用质粒pEP4EO2SEM2K,通过PCR技术扩增C-MYC-IRES2-KLF4和OCT4-IRES2-SOX2这两个片段,然后分别将PCR产物克隆到慢病毒载体pLVX-IRES-mCherry上,最终成功构建两种慢病毒质粒。3.慢病毒包装及效率检测。通过磷酸钙转染法将上述两种重组质粒作为目的质粒分别结合包装质粒pMD2.G、pSPAX2进行慢病毒包装,通过低温超速离心法浓缩收集慢病毒颗粒。将慢病毒浓缩液分别按浓度梯度侵染293T细胞,通过荧光显微镜观察和流式细胞技术检测慢病毒侵染效率。4.将SZ患者PBMCs诱导成iPSCs,并鉴定。选取上述两种合适滴度的病毒颗粒,共同侵染诱导PBMCs。重编程成功后,即可通过ALP染色、PCR、免疫荧光等技术对细胞克隆的多能性和体外分化能力进行检测。5.利用吉姆萨染色进行SZ患者来源iPSCs模型的核型分析。6.利用qRT-PCR技术比较SZ患者和正常人来源iPSCs中炎症因子表达水平的高低。结果1.实验发现利用75cm~2培养瓶包装慢病毒时,接种5-7.5×10~6个细胞于24h后进行慢病毒包装能够获得较高效率的慢病毒。2.本实验成功构建了诱导iPSCs所需要的重组慢病毒质粒pLVX-OCT4-IRES2-SOX2(以下简称OCT4/SOX2)和pLVX-C-MYC-IRES2-KLF4(以下简称C-MYC/KLF4);这两种质粒分别作为目的质粒结合包装质粒转染293T细胞后能够成功包装出2种高效的慢病毒。3.通过ALP染色、PCR、免疫荧光等各种技术对细胞克隆的多能性和体外分化能力检测成功将SZ患者的PBMCs重编程为iPSCs。4.分析检测发现SZ来源的iPSCs模型核型无异常,但其炎症因子的表达水平明显高于正常来源的iPSCs。结论1.通过单因素比较获得高效率慢病毒包装所需细胞的最佳培养时间和接种密度。2.成功建立了精神分裂症患者外周血单个核细胞来源iPSCs模型,为后续建立精神分裂症的神经细胞模型,研究SZ发病机制奠定了基础。
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R749.3
【图文】：

包装细胞,转染效率,细胞,细胞周期

2-24h）和29h（T3-29h）后进行病毒包装。如图1A和1B所示，293T细胞的生细胞数量随着培养时间逐渐增加，但图1C的细胞周期检测说明细胞处于 G1的数目并随着培养时间的延长无明显变化。之后对3组细胞进行病毒包装，如图1D所示，T2-24h和T3-29h两组病毒包装48h后GFP表达强度均明显19h组。

侵染效率,慢病毒,流式

expression level of GFP at 48h after viral packaging. Scale bar, 50μm.2.1.2 不同培养时间慢病毒侵染效率组间的比较为了进一步检测3组慢病毒侵染效率，将浓缩的病毒液按照0μL，1μL，2μL，4μL的梯度侵染293T细胞，48h后镜下观察细胞GFP荧光表达情况并拍照，结果如图2A所示。流式上机检测，细胞荧光表达率如图2B所示。镜下观察各GFP表达量与流式检测结果基本一致，二者结果均表明T2-24h和T3-29h组所包装病毒的侵染效率基本相同，但明显高于T1-19h组所包装病毒的侵染效率。

接种密度,包装细胞,转染效率,侵染效率

29图3.包装细胞不同接种密度组转染效率间的比较注：A为包装前各接种密度的细胞生长密度；B为包装前各接种密度的细胞数量；C为包种密度的细胞周期检测；D为病毒包装48h后GFP荧光表达量。标尺，50μm。Fig. 3. The transfection efficiency of packaging cells in different seeding densityote: A, the density of cell growt h at eachseeding density before packaging; B, the number oach seeding density before packaging; C, the detection of cell cycle in different seeding densackaging; D, the expression of GFP after 48h viral packaging. Scale bar, 50μm..1.4 不同接种密度慢病毒侵染效率组间的比较为了进一步检测3组慢病毒侵染效率，将病毒浓缩液按照1 μL，2 μL，4

【参考文献】