st6gal2在dnmt3b敲除引起的识别记忆障碍中的作用与机制探讨

发布时间：2020-07-21 12:52

【摘要】：DNA甲基化,作为表观遗传学的一个重要分支,可以通过调控记忆相关基因的状态而参与到记忆的形成与巩固过程中。DNA甲基化的调节主要受三种甲基转移酶的催化。DNMT3a和DNMT3b为从头甲基转移酶,负责建立新的甲基化标识;DNMT1属于维持甲基转移酶,负责识别已有的甲基化标识而维持甲修饰。三者的相互协调作用,使得甲基化在细胞分裂中可以保持延续性和稳定性。目前多数的研究主要集中于dnmt3a和dnmt1上,对于dnmt3b的生物机制探讨较少。因此我们针对dnmt3b在学习记忆方面的调节作用和机制进行了相关研究。我们通过基因芯片技术,在dnmt3b基因敲除小鼠海马区发现了异常上调的st6gal2(β-Galactosideα2,6-Sialyltransferase 2)。st6gal2编码的β-半乳糖α2,6-唾液酸转移酶2(ST6Gal2))属于唾液酸转移酶家族一员,主要分布于成年脑区(前额叶皮质和海马)并表达于组织特异时期(胚胎期)。研究发现st6gal2在小鼠胚胎发育期的表达是较为丰富的,而成年后则减少至较低水平。ST6Gal2将来自CMP-Sia中的唾液酸以α2,6-糖苷键的方式转移到糖蛋白或者糖脂末端,通过唾液酸的负极性及亲水性等特征参与到众多生物学过程中,如细胞迁移,细胞粘附,细胞新陈代谢等。已有报道称,唾液酸转移酶家族中相关成员对大脑神经元的糖蛋白和糖脂的酸化修饰,对突触可塑性起着重要的调节作用。但目前关于st6gal2的研究主要集中在肿瘤和癌症方面,如甲状腺癌,乳腺癌等,而在神经系统中的功能并没有详尽的报道。因此本次研究,我们旨在揭示st6gal2在小鼠学习记忆中的作用及机制。我们前期结果表示dnmt3b敲除小鼠会出现海马依赖性位置识别记忆障碍,并伴有st6gal2表达显著上调。因此我们推测可能是由于dnmt3b的敲除直接或间接引起的st6gal2的改变,进而影响了小鼠神经元信息的传递并产生记忆障碍。为了阐述这一机制,我们采用Cre-Loxp系统建立αCaMKII-Cre;dnmt3b~(flox/flox)条件性敲除小鼠模型,通过Real-time qPCR,Western blot实验方法验证st6gal2的表达率;通过全基因组甲基化测序(Whole Genome Bisulfite Sequenceing,WGBS)分析相关基因的甲基化变化;通过记录小鼠海马区兴奋性神经元的突触后电流和电位考察海马突触传递和可塑性的变化;采用小鼠海马脑区注射ST6Gal2抗体和AAV-st6gal2-shRNA两种手段纠正st6gal2表达上调后,观察是否可以改善基因敲除小鼠海马突触功能的异常以及识别记忆的障碍。现主要研究结果如下:1.Real-time qPCR和Western blot结果显示αCaMKII-Cre;dnmt3b~(flox/flox)小鼠海马区st6gal2 mRNA和蛋白表达均显著上调(P0.0001);2.αCaMKII-Cre;dnmt3b~(flox/flox)小鼠海马区st6gal2表达上调伴随着ncam、st8sia2的显著下调(P0.05),但st8sia 4的表达无改变(P0.05);3.αCaMKII-Cre;dnmt3b~(flox/flox)小鼠海马区st6gal1、st8sia2、st8sia4、ncam基因3’UTR区以及ncam的CDS区的甲基化的改变影响了相关基因或功能蛋白的表达;4.海马SC-CA1(Schaffer Collateral-Cornu Ammonis 1)突触通路成对脉冲反应比值(PPR,Paired-Pulse Ratio)显示两组小鼠突触前膜递质释放效率无明显差异(P0.05);5.αCaMKII-Cre;dnmt3b~(flox/flox)小鼠早期LTP(E-LTP)(P0.01)和晚期LTP(L-LTP)都存在异常;6.纠正st6gal2基因的表达上调可以改善αCaMKII-Cre;dnmt3b~(flox/flox)的LTP异常(P0.05);7.海马CA1区微量注射ST6Gal2抗体(P0.05)和AAV-st6gal2-shRNA病毒(P0.01)可以改善αCaMKII-Cre;dnmt3b~(flox/flox)小鼠的物体位置识别记忆障碍;综上所述,我们可以得出结论,选择性在海马兴奋性神经元内敲除dnmt3b基因会引起st6gal1、st8sia2、st8sia4、ncam甲基化水平的变化而导致其m RNA的表达下调,进而触发了st6gal2表达的代偿性升高;并进一步通过影响海马神经环路的突触可塑性而干扰了海马依赖的识别记忆过程,最终导致了αCaMKII-Cre;dnmt3b~(flox/flox)小鼠出现物体位置识别记忆障碍。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R749.1
【图文】：

甲基化水平,碱基

提示dnmt3b基因的敲除可能会引起DNMT3a和DNMT1 蛋白发生代偿性改变。3. WGBS 结果显示：st6gal1、st8sia2、st8sia4、ncam 甲基化水平降低差异甲基化区域 DMR 需满足三个条件：1）有差异的 C 碱基占总 C 碱基的比例大于 50%；2）DMR 长度大于 50bp；3）DMR 区域内最少含 5 个碱基。我们将基因区间划分为 up2K，5-UTR，CDS，intron，3-UTR，down2K，当鉴定的 DMR 与任意区间有关联交集达 50%以上，则定义为 DMR 关联基因。在我们的 WGBS 报告中显示，在 αCaMKII-Cre;dnmt3bflox/flox小鼠中，st6gal1、st8sia2、st8sia4、ncam 均为DMR 关联基因。在 CHH 区，st6gal1、st8sia2、st8sia4 甲基化水平分别降低 19.8%，25.7%，20.3%，主要发生在 3’UTR（19.8%，25.7%，20.3%）；而 ncam 下降 33.0%，在 3’UTR（34.4%）和 CDS（44.8%）区均有差异。CHG 区的 st8sia2 和 ncam 甲基化水平分别下降 25.4%、38.7%，主要在 3’UTR（25.4%，38.4%）区。而在 CG 区仅有 ncam 在 introns 区下降 14.0%。而 st6gal1 在内含子区也存在差异甲基化（资料未显示）。ab

蛋白表达,小鼠

4.1.1 Real-time qPCR 结果显示，αCaMKII-Cre;dnmt3bflox/flox小鼠 st6gal2 基因表达显著上调我们的前期研究通过运用基因芯片技术对 dnmt3b 敲除小鼠海马区差异表达的基因进行筛选，发现 st6gal2 基因的变化最为显著。我们用 Real-time qPCR 技术对此进行了验证，结果显示，条件敲除性小鼠的 st6gal2 基因的变化同前期结果一致，均表现为显著上调，可达 2.5 倍以上（unpaired t-test，t=5.035，P<0.0001， dnmt3bflox/floxn=15，αCaMKII-Cre; dnmt3bflox/floxn=13，图 3a）。提示 st6gal2 基因的上调可能与dnmt3b 基因的敲除相关。4.1.2 Western blot 结果显示，αCaMKII-Cre;dnmt3bflox/flox小鼠 ST6Gal2 蛋白表达显著上调为了进一步验证，st6gal2 基因的改变是否会引起功能性的蛋白的变化，我们采用了 Western blot 的方法对 ST6Gal2 蛋白进行了检测。结果发现基本与 Real-timeqPCR 的结果一致。（unpaired t-test，t=4.005， P<0.01， dnmt3bflox/floxn=7， αCaMKII-Cre; dnmt3bflox/floxn=7，图 3b）。

结果 of αCaMKII-Cre;dnmt3bflox/floxmice increased significantly. unpaired3bflox/floxn=15, αCaMKII-Cre; dnmt3bflox/floxn=13. b: ST6Gal2 protein paired t-test, t=4.005, P<0.01, dnmt3bflox/floxn=7, αCaMKII-Cre; dnmqPCR 结果显示, αCaMKII-Cre;dnmt3bflox/flox小鼠 n著下调，而 st8sia4 表达未受影响们的猜想，是否 st6gal2 异常增高伴随着 st8sia 家族成员Real-time PCR 检测了海马区 DMR 关联基因的 mRNA 表sia2 表达显著下调，而 st8sia4 表达未发生变化（ncam，un5。st8sia2，unpaired t-test，t=2.552，P<0.05。st8sia4，un.05，图 4）。

【相似文献】