褪黑素对Aβ25-35诱导原代脑皮层神经元损伤的保护作用及其机制研究

发布时间：2020-07-21 14:41

【摘要】：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是与年龄密切相关的一种神经退行性疾病。AD的主要临床表现为记忆力的逐步减退、认知功能的障碍,并逐步发展到痴呆,严重影响患者的正常生活。伴随我国人口老龄化进程的逐步加剧,AD的发病率以及病死率也随之增高,已成为严重威胁人民群众健康生活的重大疾病之一。目前,AD的发病机制仍不明确,也尚未找到有效的治疗措施。因此,阐明AD的发病机制迫在眉睫,以及寻找有效的预防和治疗措施是当今和未来全人类所面临的极大挑战。在AD患者的脑内,β-淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)的沉积,以及由此形成的细胞外老年斑,是其特征性病理学变化之一。研究表明,Aββ在AD的病理进程中起到了关键性的作用。Aβ诱发的神经元损伤与AD的关系正在被越来越多的学者所认可,尤其是Aβ寡聚肽,在其中发挥着最主要的神经毒性作用。Aβ的神经毒性作用主要涉及的机制包括氧化应激、炎症反应以及免疫反应,其中氧化应激是Aβ诱导神经元损伤的重要途径之一。研究发现,Aβ寡聚肽可导致神经元线粒体功能障碍,诱发氧化应激反应并产生大量的ROS,最终诱发突触功能障碍、神经元损伤甚至凋亡。因此,揭示Aβ导致神经元氧化应激的机制并通过抗氧化应激抑制神经元损伤是防治AD的重要策略之一。褪黑素是一种内源性激素由松果体分泌产生,具有多种生物功能。褪黑素是维持睡眠的关键因素。除此之外,褪黑素还具有抗氧化应激、抗炎症反应和抗凋亡等作用。研究发现,AD病人体内褪黑素分泌的水平,伴随着AD病程的发展逐渐下降。另外,体外实验显示,褪黑素可通过对抗Aβ诱导的线粒体的功能障碍,降低氧化应激反应从而发挥神经保护作用。然而,目前对于褪黑素干预Aβ诱导的神经损伤的分子机制尚不明确。miR-132是脑内一种特异性高表达的miRNA,在维持神经元的形态及其功能中扮演着重要的角色。研究证实,miR-132的表达量在AD病人脑内(海马以及前额叶脑皮层)显著低于正常人。且神经元的损伤和凋亡是AD病程的重要表现,而miR-132是维持神经元存活的关键因素。此外,miR-132的两个重要的下游靶点PTEN和FOX03a在AD病人的脑内均表达增加。其中,PTEN是PI3K/AKT通路中重要的负性调节因子,而FOX03a是重要的促凋亡转录因子,其功能受到AKT通路的调节。因此,miR-132/PTEN/AKT/FOX03a通路可能在AD病理进程中发挥着重要作用。基于上述研究背景,本实验假设miR-132/PTEN/AKT/FOX03a通路在褪黑素对抗Aββ诱导的神经元损伤中起到了重要的调节作用。为了证实上述推论,我们设计了如下实验:首先,我们原代培养新生小鼠的脑皮层神经元,选用不同浓度的Aβ25-35进行损伤,通过MTT检测细胞活性来选取最佳损伤浓度。然后,使用不同浓度的褪黑素进行干预,通过MTT检测细胞活性并选取最佳保护浓度。由此,我们将实验分为3组:对照组、Aβ25-35损伤组以及Aβ25-35损伤加褪黑素保护组。进一步,我们经由Hoechst/PI染色检测神经元的凋亡和坏死情况,活性氧试剂盒检测ROS的水平,JC-1染色检测线粒体膜电位的状态。实验结果表明,Aβ25-35损伤导致神经元的凋亡率、死亡率以及神经元内的ROS水平明显增加,线粒体膜电位显著降低;而褪黑素干预可显著对抗Aββ25-35导致的神经损伤作用。然后,为了揭示Aβ25-35诱导的神经元损伤以及褪黑素保护作用的分子机制,我们通过荧光定量PCR检测了 miR-132的表达变化。结果显示,与对照组相比,Aβ25-35损伤组显著降低了 miR-132的表达,而褪黑素可明显恢复miR-132 的表达水平。我们还通过 Western blot 实验,检测了 miR-132 的下游靶点PTEN和FOX03a的蛋白表达变化,发现二者在Aβ25-35损伤组的表达明显高于对照组,而褪黑素能显著下调两者的表达水平。同样借助Western blot我们还检测了 p-AKT、p-FOX03a、cleavedCaspase3的蛋白水平变化情况,结果发现Aβ25-35可明显抑制AKT以及FOX03a的磷酸化水平,并显著提高了 cleavedCaspase3的表达,而褪黑素干预可有效提高AKT以及FOX03a的磷酸化水平,并可显著降低cleavedCaspase3的表达。鉴于FOX03a的核转移在细胞凋亡过程中的作用,我们进一步针对FOX03a的表达进行了细胞免疫荧光染色,结果显示褪黑素可显著阻断Aβ25-35诱导的FOX03a核转移。最后,本实验探究了 miR-132/PTEN和PI3K/AKT分子通路在褪黑素对抗Aβ25-35导致的神经损伤中的作用。我们包装了可过表达miR-132的慢病毒,并对培养的原代脑皮层神经元进行了慢病毒转染,而后加入Aβ25-35诱导神经元损伤。通过MTT检测细胞活性,结果显示,过表达miR-132显著提高了神经元的活性,可有效对抗Aβ25-35诱导的损伤作用。另外,我们分别使用两种特异性抑制剂进行验证,结果发现PI3K/AKT通路的抑制剂LY294002显著降低了褪黑素的保护作用,而PTEN的特异性抑制剂VO-OHpic则有效的对抗了 Aβ25-35损伤作用。总之,本实验分别基于Aβ具有显著的神经毒性以及褪黑素具有一定的神经保护作用的特点,选用Aβ25-35体外损伤原代脑皮层神经元,并给予褪黑素进行干预保护,研究了其保护作用的分子机制。本实验首次提出miR-132与褪黑素在对抗Aβ25-35诱导神经损伤中的作用相关。我们发现,Aβ25-35能明显下调miR-132的表达,而褪黑素能有效恢复miR-132的表达。并且,Aββ25-35显著提高miR-132的下游靶分子PTEN和FOX03a的表达,而褪黑素可逆转这一作用。免疫荧光染色发现,褪黑素可有效阻断Aβ25-35诱导的FOX03a的核转移,从而阻断其下游凋亡基因的激活。在进一步的机制分析中,通过慢病毒转染上调miR-132的表达以及特异性抑制PTEN和PI3K/AKT通路,我们发现褪黑素可经由miR-132/PTEN/AKT/FOX03a通路对抗Aβ25-35诱导的神经损伤作用。本实验为阐明Aβ25-35诱导的神经损伤作用以及褪黑素干预保护的机制提供了新的线索。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R749.16
【图文】：

褪黑素,神经元凋亡,蓝色荧光

２．褪黑素可降低ＡＰ２５－３５诱导的神经元凋亡和坏死逡逑接下来，我们验证褪黑素对Ａ｜３２５－３５诱导神经损伤的保护作用，进行了逡逑Ｈｏｅｃｈｓｔ／ＰＩ双染实验。神经元培养到第５天，药物处理２４ｈ后进行染色。如图２逡逑Ａ所示，Ｈｏｅｃｈｓｔ为红色荧光，ＰＩ为蓝色荧光，若细胞被双染代表细胞已死亡；逡逑若只有蓝色荧光，根据细胞核形态以及蓝色荧光强度的不同，分为了正常细胞和逡逑凋亡细胞。正常胞核表现为圆形、均匀的蓝色荧光，而凋亡胞核表现为浓缩、高逡逑亮的蓝色荧光。结果显示：ＡＰ２５－３５显著增加了神经元的凋亡率（图２Ｂ，／；邋＜逡逑０．００１）和死亡率（图２逦＜邋０．００１），而褪黑素预保护组明显降低了神经元的逡逑凋亡率（图２Ｂ，ｐ邋＜邋０．００１）和死亡率（图２Ｃ，；？邋＜邋０．０１）。逡逑２６逡逑

褪黑素,神经元,细胞内,荧光强度

发生氧化反应并产生绿色荧光物质。荧光强度反映了细胞内ＲＯＳ的水平。原代逡逑脑皮层神经元分别经５邋ｈＭ邋ＡＪ３２５－３５处理２４邋ｈ、１０逦槌黑素预保护１邋ｈ后加入逡逑Ａｐ２５－３５邋（终浓度为５ｐＭ）孵育２４ｈ，然后进行ＲＯＳ检测（如图３Ａ所示）。结逡逑果显示，ＡＰ２５－３５损伤组ＲＯＳ的水平明显高于对照组（图３Ｂ，／？邋＜邋０．０１），而逡逑褪黑素预保护组能显著降低ＲＯＳ的水平（图３邋Ｂ，户＜邋０．０５）。逡逑，／逦ａ邋＝逡逑ＳＣ邋．逦■逡逑■■■邋ｆ邋ＬＬｌ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邋Ａｐ邋Ａｐ邋＋Ｍｄａ逡逑图３．褪黑素可降低ＡＰ２５－３５诱导神经元产生的ＲＯＳ水平。（Ａ）神经元培养到逡逑第５天，药物处理（５邋［ｉＭ邋ＡＰ２５－３５组、１０逦褪黑素预保护１邋ｈ后加５逦ＡＰ２５－逡逑３５组）２４邋ｈ后进行ＲＯＳ检测。绿色荧光为细胞内产生ＲＯＳ与试剂盒内的ＤＣＦＨ－逡逑ＤＡ经过氧化反应产生。荧光强度反映了细胞内ＲＯＳ的水平。（Ｂ）荧光强度的逡逑统计通过Ｉｍａｇｅ邋Ｊ软件完成。图Ａ的白色标尺为２００哗。＞＜邋０．００１邋（图Ｂ，Ａｐ逡逑＋邋Ｍｅｌａ邋ｖｓ．邋Ａ（３），＞＜邋０．０１邋（图Ｂ，ｖｓ．邋ｃｏｎｔｒｏｌ）。所得数据通过单因素方差分析逡逑和Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事后检验统计分析。（ｎ邋＝邋５邋）逡逑２８逡逑

褪黑素,线粒体膜电位,神经元,膜电位

逦山东大学硕士学位论文逦逡逑４．褪黑素可改善ＡＰ２５－３５诱导的神经元线粒体膜电位的降低逡逑线粒体膜电位（ＡＴｍ）的改变，其降低是反应早期凋亡的重要指标，我们逡逑接下来进一步检测了邋Ａ（３２５－３５对神经元Ａ＾Ｆｍ的影响以及褪黑素的保护作用。原逡逑代脑皮层神经元培养到第５天，分组为如前所述。药物处理２４邋ｈ后，进行ＪＣ－１逡逑染色，ＪＣ－１在线粒体膜电位较高时形成聚合物并且产生黄橙色的荧光，反之，ＪＣ－逡逑１单体呈现出绿色荧光。如图Ａ显示，对照组神经元的膜电位表现为黄橙色，当逡逑神经元受到ＡＰ２５－３５损伤时膜电位明显降低表现为绿色，而褪黑素保护组明显逡逑改善了膜电位的降低。统计结果显示ＡＪ３２５－３５显著降低神经元的膜电位（图Ｂ，逡逑；？邋＜邋０．０１），而褪黑素预保护可明显改善ＡＪ３２５－３５诱导的膜电位降低（图Ｂ，邋ｐ逡逑＜０．０５）。逡逑

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