Aβ调控自噬通量的效果及其分子机制研究

发布时间：2017-03-31 02:11

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【摘要】：目的：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种老年人中常见的以认知障碍为主要临床表现的神经系统退行性疾病。AD隐匿起病,发病机制至今仍未阐明。近年来,由于自噬障碍导致的AD中蛋白质修饰和降解异常成为新的研究热点。在AD典型病理特征出现之前,患者脑内已经有大量的自噬体存在,提示自噬可能是AD患者脑内的早期病理反应。本研究旨在筛选和建立稳定表达自噬标志物微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein1light chain3, LC3)的细胞系,并用于研究Aβ调控细胞自噬通量(autophagy flux)的效果,及其对细胞生长的作用和可能的机制。 方法：(1)构建稳定表达EGFP-LC3的HEK293细胞系。本文通过比较细胞转染效率和LC3蛋白表达水平,从6种细胞中筛选用于建系的细胞种类。摸索并确定遗传霉素(geneticin, G418)的浓度,转染EGFP-LC3表达质粒,对细胞进行压力选择性筛选。(2)建立Aβ诱导自噬的细胞模型。通过荧光显微镜观察,明确细胞内Ap过量表达以及细胞外Ap多肽处理这两种途径诱导EGFP-LC3-HEK293稳定细胞自噬的效果,并进一步探讨剂量、时间以及Ap聚集状态与自噬的关系。用透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)确认自噬体的细胞超微结构特征。(3)Ap诱导细胞自噬的初步机制。以10μmol/L的Aβ40、Aβ42全长肽以及疏水性氨基酸含量不同的4种Ap截短形式(Aβ1-11、Aβ12-24、Aβ25-35和Aβ35-42)分别处理EGFP-LC3稳定细胞24h,用荧光显微镜观察并计数LC3的荧光斑点数；用Western blot检测LC3BII/LC3BI、 p62、 HSP70及HSP90表达量的变化；用MTT检测特定Ap诱导细胞自噬过程中伴随的细胞活力的改变情况。 结果：(1)成功构建了稳定表达EGFP-LC3的细胞系。用700μg/mL的G418加压筛选6周,获得EGFP-LC3阳性率为100%的稳定细胞系EGFP-LC3-HEK293。(2)成功建立Ap诱导自噬的细胞模型。细胞内Ap过量表达以及细胞外Ap多肽处理这两种途径均可以诱导细胞内出现明显的LC3荧光斑点,并且具有剂量依赖性、时间依赖性以及二级结构依赖性。确定后续实验选用的条件为：聚合24h的Ap寡聚体以10μmol/L的浓度处理细胞24h。在细胞超微结构水平,TEM证实了Ap可以诱导自噬体的出现。(3)Ap诱导自噬的机制研究。首先,荧光显微镜结果显示,不同形式Aβ肽均可以诱导细胞自噬激活,并且Aβ25-35、 Aβ40和Aβ42诱导细胞内LC3荧光斑点的效果更明显。诱导自噬的效果与疏水性氨基酸含量无关。其次,Western blot结果显示,与对照组相比,Aβ42组及阳性对照组中LC3BII均有所增加,LC3BII/LC3BI的比值伴随细胞白噬增强而增加,提示LC3酯化程度的加强。同时,伴随自噬的激活,p62蛋白的表达量相应减少,提示自噬促进其降解。经巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1,BafA1)阻断自噬-溶酶体形成的环节后,与空白对照组相比,LC3BII表达水平以及LC3BII/LC3BI的比值(p0.01)增加更明显,同时p62的表达水平未见降低。与Aβ42处理组相比,AP42+BafA1组中LC3BII表达水平、LC3BII/LC3BI的比值(p0.01)以及p62表达水平(p0.05)明显增加。同样,与血清去除组相比,血清去除+Baf Al组中LC3BII表达水平、LC3BII/LC3BI的比值(p0.05)以及p62表达水平(p0.01)也明显增加。在热休克蛋白应激方面,与空白组相比,Aβ42组及血清去除组中HSP90表达量增加,而HSP70表达量减弱。最后,MTT结果显示,与Aβ40相比,Aβ42处理后伴随自噬表现出的细胞毒性更强(p0.05)。 结论：本研究成功构建了EGFP-LC3-HEK293稳定细胞系,在细胞水平证实了Aβ诱导自噬的效应和机制,并证明Aβ诱导自噬与其细胞毒性相关。为进一步探讨Aβ自噬在AD发病机制和诊治策略中的作用奠定了基础。
【关键词】：β-淀粉样肽(Aβ) 自噬 阿尔茨海默病(AD) 微管相关蛋白1轻链3(MAPLC3 LC3) 自噬小体
【学位授予单位】：北京交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 致谢5-6
• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 1 引言12-16
• 1.1 研究背景和意义12
• 1.2 自噬的研究现状及问题12-15
• 1.2.1 自噬的一般机制12-14
• 1.2.2 AD与自噬14-15
• 1.3 研究策略与创新点15-16
• 2 材料16-21
• 2.1 质粒、菌株及细胞系16
• 2.2 工具酶与试剂盒16
• 2.3 要试剂及耗材16-17
• 2.4 主要实验仪器17-18
• 2.5 主要溶液配制18-21
• 3 方法21-29
• 3.1 技术路线21
• 3.2 质粒的鉴定21-22
• 3.3 细胞培养22-23
• 3.3.1 原代神经元细胞培养22
• 3.3.2 传代细胞培养22-23
• 3.4 细胞转染与稳定细胞系的建立23-24
• 3.5 Aβ寡聚体的制备24
• 3.6 SDS-PAGE24
• 3.7 Aβ42样品透析24-25
• 3.8 Aβ42的CD谱分析25
• 3.9 自噬的诱导及鉴定25
• 3.10 免疫荧光25-26
• 3.11 溶酶体示踪26
• 3.12 细胞总蛋白的提取与测定26
• 3.13 Western blot检测LC3B、p62及HSP70/90表达26-27
• 3.14 MTT法检测细胞活力27
• 3.15 TEM确认自噬超微结构27
• 3.16 统计学分析27-29
• 4 结果29-52
• 4.1 质粒的双酶切鉴定29
• 4.2 细胞的培养与选择29-33
• 4.2.1 细胞培养29-30
• 4.2.2 细胞的选择30-33
• 4.3 稳定表达EGFP-LC3的HEK293细胞系的建立及鉴定33-34
• 4.4 圆二色谱法分析Aβ42的二级结构34-35
• 4.5 Aβ诱导的细胞自噬35-46
• 4.5.1 细胞内Aβ过量表达及外源Aβ诱导细胞自噬35-36
• 4.5.2 剂量依赖性36-38
• 4.5.3 时间依赖性38
• 4.5.4 Aβ不同聚合时间诱导细胞自噬38-40
• 4.5.5 TEM检测自噬小体超微结构40-42
• 4.5.6 截短的Aβ肽诱导EGFP-LC3稳定表达细胞的自噬42-45
• 4.5.7 巴佛洛霉素A1增强Aβ诱导自噬45-46
• 4.6 溶酶体示踪与检测46-48
• 4.7 Western blot检测48-50
• 4.7.1 Western blot检测LC3BII/I和p62的变化48-49
• 4.7.2 Western blot检测HSP70/HSP90的变化49-50
• 4.8 MTT检测Aβ诱导自噬后的细胞活性50-52
• 5 讨论52-55
• 6 结论55-56
• 参考文献56-59
• 附录59-61
• 硕士期间发表论文情况61-62
• 作者简历62-64
• 学位论文数据集#@@

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 张莹;郭舒涵;房芳;何金生;彭向雷;;自噬稳态调控与阿尔茨海默病防治策略[J];生命科学;2014年04期

2 刘诗o

本文编号：278637