酪氨酸硝化修饰对Aβ的结构和功能的影响

发布时间：2020-08-13 08:45

【摘要】：阿尔茨海默病(Alzheimer‘s disease,AD),是一种常见的神经系统退行性疾病。大脑胞外淀粉样沉积(老年斑,senile plaque SP)是AD的一种重要病理标志物,主要成分为高度聚集的β-淀粉样蛋白(amyloidβ,Aβ),一种由39-43个氨基酸组成的多肽。Aβ在脑部代谢紊乱被认为与AD的发生发展密切相关,但是具体分子机制尚不清楚。Aβ的N端含有多个组氨酸,这些组氨酸能与血红素(heme),铜离子等发生配位作用,使得Aβ与血红素和铜离子有较强亲和力,且形成的金属复合物具有较强过氧化物酶活性。蛋白质酪氨酸硝化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,硝化修饰会导致酪氨酸苯环空间位阻增加,p K_a下降,蛋白质负电荷增加并最终影响蛋白质的结构和功能。有意思的是,Aβ的氨基酸序列中含有唯一一个酪氨酸残基(Y10),十分接近其金属离子结合位点,应该极易发生硝化修饰。因此,在过氧化氢和亚硝酸盐存在的条件下,Aβ有可能发生硝化修饰,然而对于硝化Aβ结构和功能的相关研究依然处于空白。探究酪氨酸硝化修饰对Aβ的结构和功能的影响可以更加深入了解Aβ在AD发生发展过程中所扮演的角色,为AD的预防和治疗提供新的思路和治疗靶标。本文通过定制硝化修饰的系列Aβ及截短的Aβ,采用多种现代分析测试技术,系统研究了酪氨酸残基硝化修饰对Aβ结构和功能的影响,获得了以下研究成果:(1)酪氨酸硝化修饰降低Aβ_(1-40)聚集和减少细胞毒性:通过采用人工合成的Aβ_(1-40)和Aβ_(1-40)NT(10号位酪氨酸突变为3-硝基酪氨酸)作为研究对象,避免化学修饰方法得到硝化Aβ_(1-40)所造成的氨基酸氧化、双酪氨酸化的问题。结果显示heme-NO_2~--H_2O_2体系能够硝化Aβ_(1-40),硝化Aβ_(1-40)仍然能与血红素结合,两者复合物依然具有很强的过氧化物酶活性,可以继续催化硝化其它未硝化的Aβ_(1-40)。进一步检测发现酪氨酸硝化修饰能够显著降低Aβ_(1-40)聚集并抑制纤维的生成。Aβ_(1-40)酪氨酸硝化修饰后能够显著降低Aβ_(1-40)的细胞毒性。这些研究结果表明细胞有可能通过硝化修饰Aβ_(1-40),降低其聚集和细胞毒性从而防止Aβ_(1-40)大量分泌所导致的聚集和细胞毒性。(2)酪氨酸硝化修饰抑制Aβ_(1-42)聚集和细胞毒性的机理研究:选取Aβ_(1-42)和Aβ_(1-42)NT作为研究对象,证明了heme-NO_2~--H_2O_2体系能够硝化Aβ_(1-42),Aβ_(1-42)NT-heme复合物具有很强的过氧化物酶活性能够继续催化硝化Aβ_(1-42)。荧光光谱,原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)和透射电镜(transmission electron microscope,TEM)的结果都表明酪氨酸硝化修饰显著降低Aβ_(1-42)聚集并抑制纤维的生成。圆二色光谱结果表明酪氨酸硝化修饰并不影响Aβ_(1-42)自身折叠,表明酪氨酸硝化修饰有可能是通过抑制Aβ_(1-42)分子之间的相互作用达到抑制聚集目的。此外,采用氯化Aβ_(1-42)作为对照,发现Aβ_(1-42)Cl的聚集程度也显著低于Aβ_(1-42)。这些结果提示酪氨酸硝化修饰可能是通过增加酪氨酸苯环上的空间位阻达到抑制聚集的目的。最后,细胞实验结果显示Aβ_(1-42)NT的细胞毒性显著低于Aβ_(1-42),表明酪氨酸硝化修饰能够显著抑制Aβ_(1-42)聚集并降低其细胞毒性,该机制可能对Aβ_(1-42)行使正常生理功能至关重要。(3)酪氨酸硝化修饰抑制Cu~(2+)诱导的Aβ_(1-42)聚集和细胞毒性:选取Aβ_(1-42)、Aβ_(1-42)NT、Aβ_(1-16)和Aβ_(1-16)NT作为研究对象,结果表明Cu~(2+)-NO_2~--H_2O_2体系能够硝化Aβ_(1-42)。酪氨酸硝化修饰对于Aβ和Cu~(2+)的结合以及两者复合物的过氧化氢酶活性没有影响。有意思的是,Cu~(2+)能够显著改变Aβ_(1-42)的二级结构并加速Aβ_(1-42)聚集成为毒性寡聚体,而这一作用在Aβ_(1-42)NT上没有任何体现。细胞实验结果也显示无论是否存在Cu~(2+),Aβ_(1-42)NT对细胞的毒性都显著低于Aβ_(1-42)。此外,Aβ_(1-42)NT能够通过螯合Cu~(2+)减弱它对细胞的损害。这些结果提示,Aβ_(1-42)可能具有保护细胞免受Cu~(2+)毒性损害的能力,而酪氨酸硝化修饰有可能是Aβ_(1-42)正确行使该功能的一种重要的保护机制。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R749.16;O641.4
【图文】：

神经原纤维缠结,老年斑

图 1.1 a 老年斑；b 神经原纤维缠结[13]Fig 1.1 a senile plaques; b neurofibrillary tangles.阿尔茨海默病茨海默病是一种神经系统退行性疾病。该疾病最先于 1906 年 11 月由德AloisAlzheimer 发现并报道了该病的主要临床特征以及组织病理改变，随姓氏为这种病命名[14]。AD 与年龄高度相关，且随着年龄的增长，其发。随着科学技术和医疗水平的不断进步，人类平均寿命不断延长，相应问题也日益严峻，随之而来是 AD 患病人数与日俱增。据统计 2010 年60 万 AD 患者，预计到 2040 年，这一数字将翻一番。我国是人口大国，的人口老龄化问题。据推算，中国 2040 年 AD 患者人数将达到 2200 万

假说,级联,淀粉

淀粉级联假说[13]

过程图,蛋白水解,过程,成熟纤维

图 1.3 APP 蛋白水解过程[40]Fig 1.3 A schematic view of APP proteolytic cleavage.图 1.4 Aβ1-40和 Aβ1-42的氨基酸序列Fig 1.4 The amino acid sequence of Aβ1-40and Aβ1-42.Aβ1-40和 Aβ1-42不但聚集能力不同，两者的聚集方式，蛋白纤维结构也存在着大差异。如图 1.5 所示，Aβ1-40在聚集的初期会以单体，二聚体，三聚体，四聚体形式存在，并迅速达到动态平衡，而 Aβ1-42在聚集初期则能快速形成稳定的五聚体者六聚体，随后这些聚集体能够进一步聚集成为更大的寡聚体、原纤维、成熟纤维[41Bernstein 等发现 Aβ1-40在初期聚集达到平衡之后缓慢地通过不断添加单体或者二聚体的方式形成更大的聚集体直至形成成熟纤维；而 Aβ完成初期聚集之后迅速形成 1

【相似文献】