过氧化物酶体增殖物激活受体在抑郁症中的作用及机制

发布时间：2020-08-13 16:15

【摘要】：抑郁症是目前全球范围内最常见的情感障碍类精神疾病,是世界范围内导致残疾的最大原因。在过去的十年间,全球范围内抑郁症的患病人数逐年增加,且每年因抑郁症自杀的患者就有80万人,给当今社会的发展带来巨大的负担。迄今为止,关于抑郁症发病机制的学说众说纷纭,临床上用于治疗抑郁症的药物也都以单胺类神经递质为主要靶点,如选择性5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)再摄取抑制剂和5-HT受体转运抑制剂等。尽管此类药物已在临床广泛应用60余载,但其中多数药物存在起效慢、治疗范围窄,疗效差等问题,对众多的重度抑郁症患者治疗无效。因此,寻求抑郁治疗的高效新靶点已迫在眉睫。研究报道,抑郁症患者前额叶-边缘系统显现出葡萄糖低代谢的特征,且抑郁症患者也比正常人更易患有代谢综合征;而代谢综合征患者罹患抑郁症的风险则比正常人高。因此,有科学家提出“抑郁症是Ⅱ型代谢综合征”。研究显示,抑郁症和代谢综合征之间有多种共同的病理特征和发病机制,如慢性炎症反应等。在中枢神经系统(Central nervous system,CNS)中,激活小胶质细胞、星形胶质细胞或者其他髓细胞能诱导神经炎症的发生,从而促进炎症细胞因子、趋化因子以及其他炎症介质的合成与释放,最终加重神经损伤。一般认为,激活的小胶质细胞分为M1和M2两种极化形态,不同极化状态下的小胶质细胞呈现的生理功能具有明显差异。因此,研究抑郁症病理变化下的小胶质细胞M1/M2型转化有助于进一步探讨抑郁症发病的分子机制,以及探寻抑郁症治疗的新策略。过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)属于核激素受体家族的配体激活转录因子,参与糖脂质代谢、细胞分化以及炎症反应等。愈来愈多的研究表明,PPARs在多种神经系统疾病中发挥重要的神经保护作用。例如,PPARα/γ双重拮抗剂能抑制小鼠脑内的炎症反应从而减轻缺血复灌诱导的脑损伤;PPARβ/δ激动剂能抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠脑内小胶质细胞活化、减轻病理损伤以及降低死亡率等。这些研究提示,PPARs可能在抑郁症病理过程中同样扮演着重要的调控作用。文献报道,PPARγ激动药罗格列酮可改善慢性温和不可预知应激(Chronic mild unpredictable stress,CMS)诱导的小鼠抑郁样行为,但其具体的作用机制尚不明确。PPARβ/δ是脑内表达最丰富的PPARs家族受体,而有关其在脑内作用的研究却少有报道。因此,本论文工作拟研究PPARs介导的抗抑郁效应及其作用机制亟需进一步深入研究和探讨,从而为基于“非单胺类”抗抑郁新药的研发提供新的思路。基于实验室的前期工作基础,本文第一部分主要研究PPARβ/δ在抑郁症病理进程中对星形胶质细胞的调控作用及机制。建立CMS所致C57BL/6小鼠抑郁症动物模型,通过行为学、免疫组织化学以及透射电子显微镜等方法进行观察和检测,从整体水平评价激活PPARβ/δ改善CMS诱导的小鼠抑郁样行为的作用,以及对脑内海马神经元以及星形胶质细胞的保护作用;应用皮质酮刺激原代培养的星形胶质细胞建立体外应激模型,进一步研究激活PPARβ/δ介导的星形胶质细胞的保护作用及分子机制。本文第二部分主要研究PPARγ在抑郁症病理进程中对小胶质细胞表型转化的调控作用及机制。该部分工作应用脂多糖(Lipopolysaccharid,LPS)刺激原代的小胶质细胞建立体外神经炎症模型,观察PPARγ对小胶质细胞表型转化的影响。研究结果显示,拮抗PPARγ可诱导M1型小胶质细胞向M2型极化,该作用依赖于LKB1-AMPK信号通路的激活。第一部分激活PPARβ/δ对慢性温和不可预知应激所致抑郁症小鼠的治疗作用及机制目的:研究并阐明激活PPARβ/δ对CMS所致抑郁症小鼠的治疗作用及机制,为探寻抑郁症治疗的新策略和开发新型高效抗抑郁药物提供实验依据,以拓宽PPARβ/δ的药理学作用。方法:1.应用野生型C57BL/6小鼠建立CMS抑郁症动物模型;2.应用糖水偏爱试验、强迫游泳试验、旷场试验和悬尾试验进行行为学检测;3.应用免疫荧光技术观察海马脑区神经元和星形胶质细胞的数量、形态以及相关蛋白的表达情况;4.应用透射电子显微镜观察星形胶质细胞内质网的结构和形态变化;5.培养原代的星形胶质细胞,采用免疫荧光染色结合体视学计数法,鉴定原代星形胶质细胞的纯度;6.应用皮质酮(Corticosterone,Cort)刺激星形胶质细胞,建立体外应激模型;7.应用四甲基偶氮唑盐(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)试验,观察激活PPARβ/δ对皮质酮所致星形胶质细胞损伤的影响,并确定治疗的有效浓度;8.应用流式细胞术(Flow cytometry,FCM),观察激活PPARβ/δ对皮质酮所致星形胶质细胞凋亡的影响;9.应用蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)法检测内质网相关蛋白以及内质网应激介导的凋亡通路相关蛋白的表达,观察激活PPARβ/δ对皮质酮诱导星形胶质细胞内质网应激及凋亡的影响;10.应用免疫共沉淀技术,观察激活PPARβ/δ对GRP78和p-IRE1α蛋白结合能力的影响。结果:1.PPARs三种亚型在抑郁症模型小鼠海马脑区的表达下调;2.激活PPARβ/δ可显著改善抑郁症模型小鼠的抑郁样行为;3.抑郁症模型小鼠海马脑区尼氏小体形态和数量未发生变化;4.激活PPARβ/δ可抑制抑郁症模型小鼠海马脑区星形胶质细胞的内质网应激和损伤;5.激活PPARβ/δ可抑制皮质酮所致原代培养的星形胶质细胞内质网应激和损伤;6.激活PPARβ/δ可促进星形胶质细胞内GRP78与p-IRE1α的结合,并抑制内质网应激的IRE1α通过介导的星形胶质细胞凋亡途径。结论:1.激活PPARβ/δ可改善CMS模型小鼠的抑郁样症状,对海马脑区星形胶质细胞发挥保护作用;2.激活PPARβ/δ通过抑制星形胶质细胞内质网应激的IRE1α通路介导的凋亡途径,从而发挥对星形胶质细胞的保护作用。第二部分拮抗PPARγ通过促进LKB1-AMPK信号通路依赖性自噬而诱导小胶质细胞M1-M2型转化目的:研究并阐明拮抗PPARγ调节小胶质细胞转化的新作用及机制,为神经炎症相关的疾病提供潜在有效的治疗策略,同时为临床的抗抑郁治疗提供新的理论依据。方法:1.培养原代的小胶质细胞,应用免疫荧光染色结合体视学计数法,鉴定原代小胶质细胞的纯度;2.应用LPS刺激小胶质细胞,建立体外神经炎症模型;3.应用普通显微镜观察拮抗PPARγ对LPS诱导小胶质细胞阿米巴样状态的影响,并确定药物有效浓度;4.应用实时定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)观察激活PPARγ和拮抗PPARγ分别对LPS刺激后小胶质细胞M1型和M2型标记物表达的影响;5.应用免疫荧光共定位法观察拮抗PPARγ对LPS刺激后小胶质细胞M1型和M2型标记物表达的影响;6.应用FCM法观察拮抗PPARγ对LPS刺激后小胶质细胞M1型和M2型标记物表达的影响;7.应用WB法检测自噬相关蛋白以及自噬上游相关调控蛋白的表达,观察拮抗PPARγ对LPS刺激后小胶质细胞内自噬水平的影响;8.应用电子显微镜观察拮抗PPARγ对LPS刺激后小胶质细胞内自噬水平的影响;9.应用mcherry-EGFP-LC3质粒转染原代小胶质细胞,激光共聚焦观察拮抗PPARγ对LPS刺激后小胶质细胞内自噬水平的影响;10.应用吞噬实验观察拮抗PPARγ对LPS刺激后小胶质细胞吞噬功能的影响;11.应用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-ip)的方法,观察拮抗PPARγ对LKB1转录激活的靶向调控作用;12.应用si RNA转染原代小胶质细胞和BV2细胞,验证拮抗PPARγ发挥的相关调控通路是否被取消。结果:1.罗格列酮激活PPARγ不能抑制LPS所致的原代小胶质细胞M1激活,且不影响小胶质细胞M1-M2型转化;2.PPARγ拮抗剂T0070907能促进M1型原代小胶质细胞向M2型转化;3.拮抗PPARγ可逆转LPS抑制小胶质细胞自噬的作用;4.拮抗PPARγ可促进小胶质细胞自噬的作用依赖于LKB1-AMPK信号通路的激活;5.拮抗PPARγ通过激活LKB1促进M1型小胶质细胞向M2型极化;6.敲除小胶质细胞内PPARγ也可激活LKB1-AMPK信号通路,抑制LPS诱导的小胶质细胞M1型极化。结论:1.拮抗PPARγ促进LPS诱导的M1型小胶质细胞向M2型极化;2.拮抗PPARγ通过增强自噬促进小胶质细胞M1-M2表型的转变;3.拮抗PPARγ促进小胶质细胞自噬的作用依赖于LKB1-AMPK信号通路的激活。本文工作的主要创新之处:1.确认激活PPARβ/δ的抗抑郁效应;阐明激活PPARβ/δ通过抑制星形胶质细胞内质网应激介导的IRE1α凋亡途径,进而发挥对星形胶质细胞的保护作用。为基于“非单胺类”抗抑郁新药的研发提供新的思路和实验依据。2.发现拮抗PPARγ能促进M1型小胶质细胞向M2型极化的新作用;阐明其促进小胶质细胞M1-M2极化的作用机制是增强LKB1-AMPK信号通路依赖性小胶质细胞的自噬,为抗抑郁症的抗炎治疗和临床应用提供重要的理论依据。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R749.4

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