基底外侧杏仁核神经元Tmem74调控焦虑样行为的分子机制研究

发布时间：2020-08-17 19:23

【摘要】：研究背景:焦虑症是当今精神疾病中最普遍的一种精神障碍疾病,给个人及社会带来了极大的精神压力和经济负担。由于焦虑障碍病因多样,发病机制复杂,病理过程关联的分子机制研究有待深入阐明。临床上对焦虑症的主要治疗方法包括心理治疗、行为认知治疗及药物治疗,其中药物治疗贯穿始终,目前主要应用于焦虑障碍的治疗药物包括:传统的苯二氮卓类(Benzodiazepines,BDZs)、选择性五羟色胺重摄取抑制剂(Selective serotonin reuptake inhibitors,SSRIs)、五羟色胺-去甲肾上腺素重摄取抑制剂(Serotonin-norepinephrine reuptake inhibitors,SNRIs)及单胺氧化酶抑制剂等。但是这些药物由于具有依赖性、起效慢、顺应性差、停药反应等副作用而极大地限制了其在临床的应用。因此,更为深入研究焦虑症的分子机制,将有助于寻找和开发新的药物靶点,为焦虑障碍的临床治疗提供新思路。TMEMs(Transmembrane protein)是一类跨膜蛋白,近年来已报道多个TMEM蛋白在惊恐障碍、焦虑障碍等神经精神疾病中发挥重要作用。TMEM74在2008年被首次报道,近期研究表明该蛋白是一种与癌症信号通路相关的自噬诱导分子,但是尚且缺乏对TMEM74在体功能的研究。基于TMEM74在成年人的脑内高度聚集,推测对神经系统功能具有一定作用。研究目的:本研究拟通过研究TMEM74在临床焦虑患者及焦虑动物模型样本中的变化规律及调控作用;阐明Tmem74蛋白参与调控焦虑障碍的分子机制;最后通过基因操纵调控Tmem74蛋白表达,探究是否能够有效逆转小鼠焦虑表型及修复损伤的神经元功能,争取为焦虑症的诊治提供新的药物靶点。研究方法与结果:一、收集临床焦虑病人血清样本以及焦虑模型小鼠脑组织样本,通过免疫印迹法及免疫荧光染色法考察候选TMEMs蛋白在焦虑病理过程的变化规律。实验结果表明,候选蛋白分子中TMEM74在焦虑患者及焦虑小鼠样本中表达显著降低。此外,通过基因操纵在焦虑小鼠BLA区过表达Tmem74蛋白,发现能够有效逆转小鼠的焦虑表型,提示Tmem74对焦虑行为具有调控作用。二、构建Tmem74基因敲除小鼠(Tmem74-/-),通过行为学检测、电生理膜片钳记录等方法考察Tmem74基因缺失诱发的行为表型及神经元功能的变化情况。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,考察BLA锥体神经元特异性敲除Tmem74是否能够诱发焦虑表型。实验结果表明,Tmem74缺失或条件性敲除Tmem74均能够增加锥体神经元的兴奋性介导小鼠焦虑行为产生,提示Tmem74在焦虑的病理过程中扮演重要作用。三、以BLA锥体神经元为研究对象,利用电生理膜片钳记录及免疫印迹法检测,发现Tmem 74--小鼠Ih功能受损,HCN1膜蛋白表达量降低。通过药物调控HCN活性验证Tmem74缺失导致神经元兴奋性增加经由HCN通道蛋白介导。此外,通过分子生物学方法构建Tmem74不同跨膜段敲除的截断体质粒,考察Tmem74的细胞膜定位情况;利用免疫共沉淀技术考察Tmem74与HCN1之间的相互作用关系,并验证不同跨膜结构域在Tmem74生物学功能上的作用。实验结果显示,Tmem74细胞膜定位能力及与HCN1共定位关系由TM1跨膜结构介导,同时Tmem74通过与HCN1直接作用调控其膜蛋白表达及离子通道功能。四、通过基因操纵过表达Tmem74蛋白,考察Tmem74-/-小鼠行为表型及神经元活动的异常是否可逆。实验结果显示,BLA区锥体神经元特异性过表达Tmem74能够有效逆转Tmem 74缺失导致的神经元兴奋性增加、HCN通道功能损伤及其介导的焦虑表型。结论:首次发现TMEM74在临床焦虑病人及焦虑小鼠体内蛋白表达量降低,且过表达Tmem74能够治疗小鼠的焦虑表型。证明Tmem74参与焦虑障碍的调控,但对运动协调性、肌肉功能、认知功能等方面无显著影响。其对焦虑行为的调控是通过增加BLA区锥体神经元兴奋性实现的。进一步分子机制研究发现,Tmem74直接调控HCN通道增强神经元兴奋性介导焦虑行为,TM1跨膜结构域在其中发挥重要作用。此外,Tmem74对焦虑的调控是持续的、可逆的,基因操纵重新表达Tmem74能够有效修复损伤的神经元功能,逆转Tmem74基因敲除小鼠焦虑表型。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R749.72
【图文】：

蛋白,人体,焦虑症

者的血清样本（表１．１），对候选的ＴＭＥＭｓ蛋白使用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ方法进行检测。逡逑检测结果显示：ＴＭＥＭ７４蛋白在焦虑患者样本中表达水平显著降低，而其他的逡逑ＴＭＥＭｓ蛋白表达量未见显著变化（图１．２）。逡逑以上实验结果显示，ＴＭＥＭ７４在人脑内集中分布，并且在焦虑患者体内表达逡逑降低，提示ＴＭＥＭ７４在焦虑障碍中可能存在重要作用。那么ＴＭＥＭ７４在焦虑症逡逑中的具体作用如何？是否可以调控焦虑行为表型？具体的作用机制及上下游调控逡逑蛋白是什么？本课题后续研究将针对这些问题进行深入阐明。逡逑ＲＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋（ＴＰＭ）逡逑Ｔｉｓｓｕｅ邋ｂｍｅｍ７４邋Ｔｍｅｍ１６８邋Ｔｍｅｍ３９ａ邋Ｔｍｅｍ１０６ｂ邋Ｔｍｅｍ１０７邋＊邋Ｔｍｅｍ１３２ｅ邋Ｔｍｅｍ２３７逡逑＼逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逡逑Ｂｒａｉｎ逦｜邋■逦■逦■■■１逦■■逦｜逦■■■邋｜邋｜ＨＩ逡逑＾１逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逡逑ｔｉｓｓｕｅｓ逦Ｉ逦丨逦丨逦＿Ｈ逡逑Ｉ逦Ｉ逦晒逦■逡逑Ｂｏｎｅ邋ｍａｒｒｏｗ邋＆逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逡逑ｉ

蛋白,焦虑症,内集,人脑

小鼠,慢性束缚应激,表型,焦虑症

们对同年龄的雄性ＷＴ小鼠进行慢性束缚应激造模。连续造模１４天后用行为学逡逑方法检测焦虑水平，结果显示与雄性同龄对照组小鼠相比，雄性ＣＩＳ小鼠存在显逡逑著的焦虑样表型（图１．３ａ－ｃ）。行为学实验后，采集小鼠的ＢＬＡ脑区样本，使用逡逑免疫突光及Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ方法检测Ｔｍｅｍ７４蛋白表达情况。免疫焚光结果显示，逡逑在ＣＩＳ小鼠ＢＬＡ脑区Ｔｍｅｍ７４表达显著降低（图１．３邋ｄ，ｅ），Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ结果显逡逑示Ｔｍｅｍ７４的膜蛋白表达量降低４０％左右（图１．３邋ｆ）。由于在临床上，焦虑症在逡逑男性和女性中均发病，为了考察Ｔｍｅｍ７４在焦虑小鼠中变化是否存在性别差异，逡逑我们对同龄的雌性ＷＴ小鼠进行慢性束缚应激造模。高架十字迷宫及旷场实验结逡逑果显示，与同性别对照组小鼠相比雌性ＣＩＳ小鼠存在焦虑样表型（图１．４邋ａ－ｄ）。逡逑同时，雌性ＣＩＳ小鼠ＢＬＡ脑区Ｔｍｅｍ７４的膜蛋白表达水平也显著下降（图１．４邋ｅ）。逡逑以上结果提示，Ｔｍｅｍ７４蛋白水平在焦虑模型小鼠脑内显著降低，并且无性别差逡逑异。那么

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