QDs-SA量子点荧光成像阿尔茨海默病细胞模型APP、Aβ蛋白的实验研究

发布时间：2020-09-12 18:58

　　 背景与目的 阿尔茨海默病是以进行性认知功能障碍和行为损害为主要特征的中枢神经系统退行性病变。β-淀粉样蛋白是阿尔茨海默病特征性的病理改变老年斑的主要成分,已有研究表明阿尔茨海默病发病早期即存在Aβ蛋白的沉积,其沉积部位、面积和量与AD认知功能障碍程度密切相关。量子点是一种新型的荧光分子探针,与传统的荧光染料相比,具有荧光强度高、光学稳定性好等优势,将量子点与APP、Aβ蛋白特异结合,发展AD分子光学成像技术,指导阿尔茨海默病的早期诊断具有广阔的发展前景。本项目拟构建pcDNA3.1/APP595/596并列突变质粒,稳定转染入人胚肾HEK293细胞,建立阿尔茨海默病转基因细胞模型;应用量子点对APP、Aβ蛋白靶向标记,并将其与传统荧光染料对比,在评估量已点生物相容性的同时,获取量子点荧光成像强度和荧光稳定性的相关资料,为量已点早期应扩于阿尔茨海默病的分子影像诊断打下基础。 方法 1)对pcDNA3.1/APP质粒(美国Pittsburgh大学的Perez博士惠赠)进行测序,证实除质粒本身第595和596位氨基酸密码子存在并列突变外,序列的第4位碱基有意外突变(C→G),并影响到正常氨基酸的表达,亮氨酸(Leu)变成了缬氨酸(Val)。因此实验拟行质粒APPcDNA第4位碱基的定点突变。从原始质粒克隆模板中,利用PCR方法扩增目的基因APP695cDNA,将目的基因和目的载体pcDNA3.1分别酶切;纯化酶切产物后定向连接,并将其转化细菌感受态细胞,对长出的克隆行PCR鉴定,PCR鉴定为阳性的克隆送测序并行比对分析。2)将点突变后pcDNA3.1/APP595/596质粒转染至HEK293细胞建立稳定表达株,细胞免疫荧光和Western-blot方法检测转染细胞APP的表达和Aβ蛋白生成情况。3)采用细胞形态学、MTT分析法结合流式细胞检测凋亡技术,系统考察QDs-SA量子点(浓度2.5～25nm)对稳定转染pcDNA3.1/APP595/596质粒的HEK293细胞的毒性作用。4)应用激光共聚焦荧光成像和流式细胞技术,对QDs-SA量子点靶向标记阿尔茨海默病转基因细胞模型中APP、Aβ蛋白的荧光进行检测,同时与基于传统荧光染料标记的免疫荧光分析方法进行比较。 结果 1)应用DNAStar软件对阳性克隆测序结果与GenBank中APP基因序列比对,证实原序列中的错义突变G已被突变回C,第4位点碱基定点突变完成,pcDNA3.1/APP595/596并列突变质粒构建成功。2)Western-blot在稳定转染了pcDNA3.1/APP595/596质粒的细胞中检测到目的条带,而转染空载体组细胞未见APP蛋白表达。细胞免疫荧光染色后,共聚焦荧光显微镜下观察APP基因转染后能够生成APP和Aβ蛋白,前者主要定位于细胞胞膜,Aβ蛋白主要表达于近膜胞浆,细胞膜上也有表达。3)在2.5～25nm浓度范围内,与QDs-SA量子点共育24小时后,转染质粒的HEK293细胞形态学无明显改变;MTT示量子点作用细胞吸光度值与对照组相比未见明显差异;不同浓度量子点组间吸光度值比较亦无统计学意义(P＞0.05)。流式细胞检测空白对照组与各浓度组间凋亡早期细胞百分率差异无统计学意义(P＞0.05)。4)在波长为388nm紫外光激发下,QDs-SA量子点的最大荧光发射峰波长约为605±10nm,半峰宽小于35nm。激光共聚焦显微镜荧光分析示QDs-SA量子点标记APP和Aβ蛋白相较于传统Cy3荧光染料的平均荧光密度值更大(P＜0.05);488nm激发光连续激发12分钟,QDs-SA量子点荧光标记的APP和Aβ蛋白仍发射较强的橙红色荧光,荧光强度分别下降了27.87%、29.25%,而传统荧光染料Cy3荧光强度下降幅度高达79.60%和76.82%。流式细胞仪检测QDs-SA量子点和Cy3活细胞标记膜蛋白APP阳性率差异无统计学意义(P＜0.05),QDs-SA量子点荧光标记APP蛋白的流式荧光图形呈宽端型,Cy3标记的APP流式荧光图形呈扁平形,平均荧光强度差异有统计学意义(P＜0.05)。 结论 1)成功构建了在真核细胞中能高效表达人APP和Aβ蛋白的真核表达载体,并稳定转染HEK293细胞建立阿尔茨海默病转基因细胞模型。2)在一定的浓度范围内,QDs-SA量子点对细胞形态学、细胞生长和增殖活性无明显影响,具有较好的生物相容性。3) QDs-SA量子点能有效识别阿尔茨海默病转基因细胞模型中APP和Aβ蛋白;QDs-SA量子点标记APP和Aβ蛋白荧光成像在光稳定性和荧光强度等方面均优于传统的Cy3荧光染料标记的免疫荧光成像。
【学位单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2009
【中图分类】：R749.16
【部分图文】：

③快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1一2分钟;④每管加800川LB培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟使细菌复苏;⑤将150川已转化的感受态细胞转移到含20mmol/LMgSO;和AMP抗性(100u留ml)的LB琼脂培养基上;⑥将平板置于室温直至液体被吸收;⑦倒置平皿，于37℃培养16小时;⑧长出的克隆进行后续PCR鉴定。柳挑选克隆行PCR鉴定，阳性克隆再抽提质粒，并测序行进一步鉴定。l)基本流程图

图1一3原始质粗测序鉴定图上图编码为06040082序列为待测序列，与NCBI公布人源APPcDNA序列比对发现第4位碱基由C突变为G，同时在第1896和1897碱基位点存在并列突变(G一T，A~C).4.2点突变结果.4.2.1真核表达载体信息:一几仍三一贬哎一三Pu.IH一。绪一8尸卜身V一工三巾m荟一仍m一比UO山>匡OU山荟一S中(--).峥藐藤套

50.bp250卜p图1一 6PCR扩增片段酶切电泳图1:PCR片段酶切产物2:Marker 1.4.2.4PCR酶切产物连接入真核表达载体转化行阳性克隆的PCR鉴定将酶切后的目的基因APP695与真核表达载体PcDNA3.1(一)相连接，将其转化感受态培养后挑取克隆行PCR鉴定，筛选阳性克隆。如图1一7所示，第12道在500bP左右可见目的条带。5灿3灿2灿 1.5灿1灿一 50bP 500bp 250bp 100b

【引证文献】

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1 胡华;周德生;喻嵘;孙晓鹏;覃仁安;杨洋;王佳君;;复方丹参片对阿尔茨海默病转基因细胞模型Aβ表达的影响[J];中国中西医结合杂志;2012年12期

本文编号：2817781