研究背景 胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是糖尿病重要的发病机制之一,贯穿于糖尿病的发生、发展全过程,同时也是导致糖尿病并发症的根源。流行病学研究显示:胰岛素抵抗综合征患者心血管疾病和脑卒中的风险增加3倍,病死率明显增高。 研究结果显示,胰岛素抵抗是认知功能下降的重要危险因素。认知功能损害早期主要表现为学习和记忆功能的下降。中枢胆碱能系统在学习和记忆行为中有重要的调节作用,保持其功能正常,是维持哺乳动物学习记忆的必要条件。胰岛素抵抗以高胰岛素血症、糖脂代谢紊乱等为主要特征。而长期高血糖能引起机体内多种物质发生糖基化反应,产生糖基化终末产物(advanced glycation endproducts,AGEs)。近来的研究显示:糖基化终末产物-糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end product,RAGE)通路激活是糖尿病靶器官损害的重要机制之一,该通路活性增强与衰老、认知障碍及外周神经病变有密切的关系。吡格列酮属于噻唑烷二酮类药物,是一种新型的胰岛素增敏剂,通过增加组织对胰岛素的敏感性改善胰岛素抵抗,降低血糖水平,其生物学效应主要是通过激活过氧化物酶体增殖物活化受体γ(Peroxisome Proliferator-activatedreceptor gammar,PPARγ)实现的。有研究报道PPARγ激活剂能够减少缺血再灌注脑梗塞体积,具有脑保护作用。 目前国内未见对胰岛素抵抗时认知功能下降机制以及PPARγ激活剂对中枢AGEs-RAGE信号通路影响的研究报道。 目的 (1)探讨高果糖诱发的胰岛素抵抗大鼠认知功能、胆碱乙酰转移酶(cholineacetyltransferase,ChAT)活性及胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)的变化 (2)探讨高果糖诱发的胰岛素抵抗大鼠脑组织AGEs-RAGE损伤途径的变化。 (3)探讨吡格列酮(Pioglitazone,PIO)在胰岛素抵抗大鼠脑损伤中的作用及机制 方法 45只6～8周龄清洁级健康雄性Wistar大鼠(购于山东大学实验动物中心),体重180～200g,适应性喂养1周,从中随机选取10只作为正常组(NC组),标准啮齿类动物饲料喂养,饮用自来水;其余35只标准啮齿类动物饲料喂养,饮用10%的果糖水,(参考Reaven GM)制作胰岛素抵抗模型。4周后根据胰岛素抵抗指数(insulin resistance index,IRI)将制作成功的胰岛素抵抗模型动物随机分为胰岛素抵抗组(IR组)和吡格列酮组(PIO组)。吡格列酮干预方法:在检测模型成功后,IR组及PIO组继续标准啮齿类动物饲料喂养,饮用10%的果糖水至实验结束,PIO组同时按10 mg/(kg·d)灌胃给药,NC组与IR组灌服相应体积的生理盐水,共计12周。干预12周后,进行以下测试:1.测定各组大鼠体重、血糖、胰岛素水平,计算胰岛素抵抗指数;2.通过Morris水迷宫实验观察大鼠认知功能改变情况;3.比色法测定脑组织中ChAT活性;4.免疫荧光检测脑组织AGEs的表达;5.Western blot脑组织中PPARγ、RAGE、磷酸化核转录因子-κB(Phospho-NF-κB p65,Ser536)、IGF-1表达。6.对脑组织切片进行尼氏染色,以观测各组大鼠脑组织形态学及尼氏体改变 结果 1各组大鼠体重、空腹血糖、胰岛素水平的比较 干预第12周末IR组、PIO组大鼠体重、空腹血糖较NC组有增高趋势,但差异无统计学意义(P＞0.05);IR组胰岛素水平较NC组明显增高(P＜0.01),PIO组胰岛素水平较NC组增高(P＜0.05);PIO组胰岛素水平明显低于IR组(P＜0.01)。 2 Morris水迷宫实验成绩比较 IR组逃避潜伏期较NC组明显延长(P＜0.01),PIO组逃避潜伏期较NC组延长(P＜0.05),PIO组逃避潜伏期较IR组明显缩短(P＜0.01) 3.胆碱乙酰转移酶活性比较 与NC组(69.042±7.6603)比较IR组(36.9225±5.0859)ChAT活性降低,差异有显著性(P＜0.01)。与IR组比较PIO组(50.0825±6.2224)ChAT活性增强,差异有显著性(P＜0.05),但仍低于NC组(P＜0.01)。 4.免疫荧光法检测AGEs的表达 NC组大鼠海马、皮层细胞排列密集,可见AGEs在细胞浆表达,表达较弱;IR组细胞排列疏松,AGEs表达呈强阳性;与IR组相比较,PIO组细胞排列较紧密;AGEs表达强度减弱,阳性细胞数减少。 5.Western blotting检测脑组织PPARγ、RAGE、Phospho-NF-κB、IGF-1表达 ①IR组和PIO组RAGE的蛋白表达水平较NC组升高,分别为NC组的1.68倍、1.24倍;与IR组相比,PIO组RAGE的蛋白表达水平下降26.2%,差异有统计学意义(P＜0.01)。 ②IR组和PIO组磷酸化NF-κB的蛋白表达水平较NC组升高,分别为NC组的1.58倍、1.27倍;与IR组相比,PIO组磷酸化NF-κB的蛋白表达水平下降19.6%,差异有统计学意义(P＜0.01)。 ③IR组和PIO组PPARγ的蛋白表达水平较NC组降低,分别为NC组的0.72%、0.89%;与IR组相比,PIO组的PPARγ蛋白表达水平升高,为IR组的1.23倍,差异有统计学意义(P＜0.05)。 ④IR组和PIO组IGF-1的蛋白表达水平较正常对照组降低,分别为NC组的35.7%和48.05%;与IR组相比,PIO组的IGF-1蛋白表达水平升高,是IR组的1.35倍,差异有统计学意义(P＜0.05) 6.组织形态学改变 尼氏染色:NC组各脑区神经元形态正常,胞核膜和核仁清晰;IR组小鼠的额叶皮质、海马的细胞排列稀疏,细胞间隙增大,细胞胞浆内Nissl体减少或消失。PIO组比IR组有所改善,神经元细胞排列尚整齐、密集,胞浆中Nissl体较丰富。 结论 1.胰岛素抵抗大鼠神经细胞发生病理性损害,认知功能下降,可能与脑组织IGF-1表达下降,ChAT活性降低,神经元凋亡增加,乙酰胆碱(Acetylcholine,ACh)释放减少有关。 2.胰岛素抵抗大鼠脑皮质、海马区的AGEs、RAGE、磷酸化NF-κB蛋白表达增加;PPARγ表达降低。提示AGEs-RAGE及下游通路的激活可能参与脑组织损伤过程。AGEs-RAGE通路活性增强与PPARγ活性降低有关。 3.吡格列酮通过促进PPARγ表达增加,增强中枢ChAT活性,增加IGF-1表达,维持胆碱能神经功能,对模型大鼠的学习记忆功能减退具有改善作用。同时吡格列酮通过PPARγ对AGEs-RAGE通路产生抑制作用,继而改善胰岛素抵抗大鼠的认知功能。 意义 本课题通过运用Western blot、免疫荧光、尼氏染色、比色法等方法,观察了吡格列酮干预前后胰岛素抵抗大鼠脑组织中AGEs、RAGE、NF-κB、PPARγ、ChAT、IGF-1表达的变化以及大鼠逃避潜伏期的变化,探讨了IGF-1、ChAT在胰岛素抵抗大鼠脑组织中的变化,AGEs-RAGE通路在胰岛素抵抗脑损伤机制中的作用,以及吡格列酮对胰岛素抵抗大鼠脑组织损伤的作用和对AGEs-RAGE通路的影响,为临床胰岛素抵抗中枢神经损伤的防治提供理论依据。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2008
【中图分类】：R587.1;R749.1
【部分图文】：
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IR组PIO组NC组PIO组图3免疫印迹检测各组大鼠脑组织即AR丫、RAGEs、phospho一NF一KB蛋白表达相对数比较 Fig3TheanalysisofPPARY、 RAGESandPhosPho一NF一沼Protein inratsbyWesternblot、IGF一lexPreSS10n
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本文编号：
2843021
