血管性痴呆大鼠海马DG区几种氨基酸含量的变化

发布时间：2020-11-02 19:35

　　 目的本实验利用长期双侧颈总动脉结扎法制备血管性痴呆(Vascular dementi,VD)大鼠模型,并观察大鼠海马齿状回(Dentate gyrus,DG)区细胞外液中几种氨基酸含量的变化,探讨血管性痴呆记忆认知障碍和海马DG区氨基酸类物质含量的关系。方法将成年Wistar大鼠(250～300 g)随机分成对照组(n=6)、假手术组(n=6)和模型组(VD组)(n=6)。对照组不做手术,假手术组只剥离双侧颈总动脉但是不结扎,模型组剥离并永久性结扎双侧颈总动脉。术后30 d开始采用Morris水迷宫进行学习记忆的行为学观察;训练结束后利用脑内微量透析法和高效液相色谱法测定海马DG区细胞外液中的7种氨基酸类物质(包括天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、牛磺酸、丙氨酸和γ-氨基丁酸)的含量。结果 (1)VD组与假手术组、对照组比较,水迷宫实验的逃避潜伏期明显延长(P0.05),假手术组和对照组之间无明显差异(P0.05)。(2)VD组海马DG区细胞外液中的谷氨酰胺、牛磺酸、丙氨酸和γ-氨基丁酸的含量均明显高于对照组和假手术组,(P均0.05)。其余3种氨基酸无明显变化(P均0.05);假手术组的海马DG区7种氨基酸含量与对照组比较无明显差异(P均0.05)。结论 (1)采用双侧颈总动脉结扎术能有效制备VD模型;(2)VD可能与海马DG区谷氨酰胺、牛磺酸、丙氨酸和γ-氨基丁酸含量增加有关。
【部分图文】：

手术前后大鼠学习记忆改变；每次训练开始前１ｄ，为了让大鼠熟悉环境，让大鼠在水池中自由游泳３ｍｉｎ，此时撤出平台；为了评估大鼠的空间学习和记忆能力，我们进行大鼠定位航行实验，设定为每天训练４次，第５次进行测试，共需５ｄ完成；将大鼠从入水点背向水池中央放置，记录６０ｓ内大鼠从入水到爬上平台所需的时间，即逃避潜伏期；有的大鼠在６０ｓ内能够找到平台，让其在平台上站立１０ｓ，有的大鼠找不到，将大鼠引上平台，并让其停留１０ｓ，此时潜伏期记为６０ｓ。图１Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫行为学检测系统１．５海马区微量透析探针及其外套管固定手术大鼠用１０％水合氯醛（３００ｍｇ／ｋｇ）腹腔注射麻醉，待大鼠完全麻醉后头部去毛备皮，将大鼠腹卧位固定于立体脑定位仪上；根据Ｐａｘｉｎｏｓ和Ｗａｔｓｏｎ所绘制的大鼠脑图谱，将透析探针外套管插入到ＤＧ区；ＤＧ区定位以前囟为参考点，后退３．１～３．３ｍｍ，旁开（左右皆可）１．９～２．１ｍｍ，深度为高于ＤＧ区１．５ｍｍ的位置，然后用牙托粉将其固定在大鼠颅骨上；术后把大鼠放在长３０ｃｍ，宽３０ｃｍ，高３５ｃｍ的实验用不透明的塑料小箱中饲养；第２ｄ大鼠状态恢复后经外套管将透析探针插入到海马ＤＧ区，用蜡将探针固定在外套管上，探针超出外套管１．５ｍｍ（前端附有半透膜），待大鼠安静后进行脑部微量透析实验；微量透析探针及其外套管埋入（图２）。·３３５卒中与神经疾菠２０１２年１２月第１９卷第６期

图２微量透析探针及其外套管的埋入位置模式图１．６微量透析样本的收集和氨基酸含量的测定根据Ｊｉｎ等的方法［５］，微量透析探针连接微量泵，向大鼠海马ＤＧ区灌流Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ液，流速为１．５μＬ／ｍｉｎ，待稳定９０ｍｉｎ后开始进行样本收集，每管收集量为１５μＬ，收集１０ｍｉｎ，保存在－８０℃冰箱，以备进行氨基酸含量分析；每只大鼠收集３个管，取其平均值；氨基酸含量测定采用高效液相色谱和电化学检测系统（ＥＣＤ－３００），取１２μＬ样本和４ｍＭ的ＯＰＡ溶液３μＬ，混匀在室温下反应２．５ｍｉｎ，抽取上述溶液１０μＬ，通过手动进样口注入到系统中进行分析，其参数为流动液流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ，压力＜１０Ｍｐ。１．７组织学鉴定待样本收集完后将大鼠麻醉处死，小心剥离脑组织，固定在１０％甲醛溶液中，采用连续手动冰冻切片法做厚度为６０μｍ的脑切片，干燥１ｄ后即可在显微镜下观察。１．８统计学处理所有实验数据均用平均值±标准误（ｍｅａｎｓ±ＳＥ）表示，采用ｔ检验或单因素方差分析。Ｐ＜０．０５表示差异有统计学意义。２结果２．１ＶＤ模型大鼠空间学习记忆能力造模前对照组、假手术组和ＶＤ组大鼠的逃避潜伏期随着训练天数的增加逐渐缩短，各组间无显著性差异（表１）。造模３０ｄ后对照组和假手术组与造模前相似，其逃避潜伏期也随训练天数的增加而明显减小，而ＶＤ组的逃避潜伏期虽然也有随训练天数而减小的倾向，但减小幅度缓慢，与对照组和假手术组相比较有显著性差异（表２）。２

计学意义。２结果２．１ＶＤ模型大鼠空间学习记忆能力造模前对照组、假手术组和ＶＤ组大鼠的逃避潜伏期随着训练天数的增加逐渐缩短，各组间无显著性差异（表１）。造模３０ｄ后对照组和假手术组与造模前相似，其逃避潜伏期也随训练天数的增加而明显减小，而ＶＤ组的逃避潜伏期虽然也有随训练天数而减小的倾向，但减小幅度缓慢，与对照组和假手术组相比较有显著性差异（表２）。２．２组织学鉴定根据Ｐａｘｉｎｏｓ＆Ｗａｓｔｏｎ的大鼠脑图谱，对脑切片标本进行了组织学鉴定。图３是一张典型的组织学显微镜照片，图中透析探针位于海马ＤＧ区。定位不准确者不计入统计。表１造模前各组大鼠逃避潜伏期的比较（ｓ）天数逃避潜伏期对照组假手术组ＶＤ组１ｄ６０６０６０２ｄ５１．４７±２．３５５０．５９±２．５４５０．５９±１．１８３ｄ４０．９８±２．１６４２．３４±１．５６４２．３４±２．０７４ｄ３０．００±２．１３２９．８７±２．３５３０．０４±２．１５５ｄ１７．９４±１．７２１８．４２±１．６７１８．７９±１．９９表２造模３０ｄ后各组大鼠逃避潜伏期的比较（ｓ）天数逃避潜伏期对照组假手术组ＶＤ组１ｄ５０．９８±２．２４５２．４８±２．５４６０２ｄ４０．７８±２．６７４１．５９±３．４１５５．５９±３．６７△３ｄ３３．４３±２．５３３４．５３±２．３６４９．３４±３．１２△４ｄ２３．５７±２．３１２３．２７±２．１９４１．１４±２．５５△５ｄ１４．２８±２．４５１５．２８±２．１１３２．８９±２．７９△注：与对照组和假手术组比较，△Ｐ＜０．０５图３微量透析探针位置标记
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