慢病毒介导的过表达GSK3β小鼠与抑郁障碍发生的研究

发布时间：2020-11-03 13:38

　　 目的: 构建过表达GSK3β慢病毒载体颗粒,观察小鼠海马齿状回区注射慢病毒后GSK-3β表达的改变,研究慢病毒介导的海马GSK3β过表达对小鼠糖水实验、悬尾实验、强迫游泳等行为的影响,通过慢性应激造模小鼠,初步探讨GSK3β与抑郁障碍的关系。 方法: 1、构建GSK3β基因过表达的含绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的慢病毒载体。2、将实验动物分为3组:正常组、空载体组和GSK3β过表达组,分别将1ul空载体和含GSK3β基因的慢病毒载体定位注射空载体组和GSK3β过表达组小鼠海马齿状回区,7天后灌注取脑组织做冰冻切片,荧光显微镜下观察GFP与GSK3β表达情况,以及取新鲜组织提取总蛋白及总RNA,通过western blot和RT-PCR的方法检测GSK3β的表达情况;3、48只C57BL/6J小鼠随机分为6组,每组8只,分别为①Lvx-GSK3β+CMS组②Lvx-GSK3β组③Lvx-GFP+CMS组④Lvx-GFP组⑤正常对照+CMS⑥正常对照组。①-④组手术后7天,进行21天的CMS,并观察各组小鼠糖水实验、悬尾实验、强迫游泳实验的变化。 结果: 1.成功构建出GSK3β的T克隆载体;2.成功构建过表达GSK3β的慢病毒;3.慢病毒定位注射后7天,GSK3β过表达组小鼠海马组织内GSK3βmRNA水平和蛋白水平明显高于空白组与空载体组(P=0.001),而空白组与空载体组GSK3βmRNA和蛋白表达水平无明显差异(P0.05);定位注射后7天,GSK3β过表达组小鼠海马齿状回区GSK3β阳性细胞数量多,染色深;空白组与空载体组GSK3β阳性细胞较少,染色浅;4.糖水实验结果单因素方差分析显示组间存在明显差异(F=11.5)。LVX-GSK3β组和LVX-GFP组T检验,显示LVX-GSK3β组糖水偏爱明显低于LVX-GFP组(P=0.001), LVX-GSK3β组和正常对照组T检验,显示LVX-GSK3β组糖水偏爱明显低于正常对照组(P=0.001),而LVX-GFP组和正常对照组间则未发现差异。LVX-GSK3β+CMS组和LVX-GFP+CMS组T检验,显示LVX-GSK3β+CMS组糖水偏爱明显低于LVX-GFP+CMS组(P=0.023), LVX-GSK3β+CMS组和正常对照+CMS组T检验,显示LVX-GSK3β+CMS组糖水偏爱明显低于正常对照+CMS组(P=0.025)。但LVX-GFP+CMS组和正常对照+CMS组间则未发现差异;LVX-GSK3β+CMS组与LVX-GSK3β组间没有发现差异,但有一偏低的趋势(P=0.088);5.强迫游泳实验结果单因素方差分析显示组间存在明显差异(F=35.35)。LVX-GSK3β组和LVX-GFP组T检验,显示LVX-GSK3β组不动时间明显高于LVX-GFP组(P=0.001), LVX-GSK3β组和正常对照组T检验,显示LVX-GSK3β组不动时间明显高于正常对照组(P=0.001),而LVX-GFP组和正常对照组间则未发现差异。LVX-GSK3β+CMS组和LVX-GFP+CMS组T检验,显示LVX-GSK3β+CMS组不动时间明显高于LVX-GFP+CMS组(P=0.003), LVX-GSK3β+CMS组和正常对照+CMS组T检验,显示LVX-GSK3β+CMS组不动时间明显高于正常对照+CMS组(P=0.035),但LVX-GFP+CMS组和正常对照+CMS组间则未发现差异。LVX-GSK3β+CMS组与LVX-GSK3β组T检验,结果显示LVX-GSK3β+CMS组不动时间明显高于LVX-GSK3β组(P=0.001)。6.悬尾实验结果单因素方差分析显示组间存在明显差异(F=8.17)。LVX-GSK3β组和LVX-GFP组T检验,显示LVX-GSK3β组不动时间明显高于LVX-GFP组(P=0.036), LVX-GSK3β组和正常对照组T检验,显示LVX-GSK3β组不动时间明显高于正常对照组(P=0.026),而LVX-GFP组和正常对照组间则未发现差异。LVX-GSK3β+CMS组和LVX-GFP+CMS组T检验,显示LVX-GSK3β+CMS组不动时间明显高于LVX-GFP+CMS组(P=0.03), LVX-GSK3β+CMS组和正常对照+CMS组T检验,显示LVX-GSK3β+CMS组不动时间明显高于正常对照+CMS组(P=0.046),但LVX-GFP+CMS组和正常对照+CMS组间则未发现差异。LVX-GSK3β+CMS组与LVX-GSK3β组T检验,结果显示LVX-GSK3β+CMS组不动时间明显高于LVX-GSK3β组(P=0.005)。 结论: 1、成功构建过表达GSK3β慢病毒。2、成功建立过表达GSK3β的动物模型。3、过表达GSK3β的小鼠,在没有应激时,其糖水实验、强迫游泳实验、悬尾实验均与正常组有明显的差异。提示小鼠海马GSK3β的增多会产生抑郁样行为。4、LVX-GSK3β的小鼠,在应激后,其糖水实验、强迫游泳实验、悬尾实验的结果均与LVX-GFP+CMS组和正常对照+CMS组有明显差异,并且在强迫游泳实验和悬尾实验中发现LVX-GSK3β+CMS组不动时间明显高于LVX-GSK3β组,提示过表达GSK3β小鼠可能对应激更加敏感。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2011
【中图分类】：R749.4
【部分图文】：

山西医科大学结果、慢病毒载体的构建与鉴定结果1.1 T 克隆载体的双酶切鉴定结果构建的 T 克隆载体选择 6个克隆子进行双酶切鉴定，由图 1.可知 1/6号酶切鉴定结果显示出了正确的大小为 1263 bp 酶切条带，所以编号为 1 和 6为正确的 T 克隆载体。1 2 3 4 5 6

图 1.T 克隆载体的双酶切鉴定结果1.2 转化后的 GSK3β-T 酶切鉴定进行转化后的 GSK3β-T 酶切鉴定，从我们可以发现 1-4 个正确的转化子（图 2），其中 1、2、4 的结果较好，从 3 个中任续的实验。

对照病毒 Lvx-zsgreen Lvx-GSK3β-zsgreen图 3. 293T 细胞的免疫荧光结果（20×）1.4 在体实验的 RT-PCR 和 Western Blot 检测小鼠海马 GSK3β 的表达水平1、 慢病毒定位注射后 7 天，取小鼠海马组织，利用 RT-PCR 检测海马内 GSKmRNA 水平，发现 GSK3β 过表达组 GSK3β mRNA 水平明显高于空白组与空载体（P=0.001）；而空白组与空载体组 GSK3β mRNA 表达水平无明显差异（P0.05）。图 4. 慢病毒注射后 7 天各组小鼠海马 GSK3β mRNA水平空白组 空载体组 GSK3β 过表达组GSK3ββ - actin
【参考文献】

相关期刊论文 前7条

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本文编号：2868648