第一部分基底外侧杏仁核gephyrin亚硝基化修饰在大鼠焦虑样行为中的作用目的:大量研究表明:在焦虑症的发生发展过程中,杏仁核脑区的抑制性神经递质γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)及其受体介导的抑制性神经突触传递功能降低扮演了重要角色。桥尾蛋白(gephyrin)是调控抑制性突触后功能的重要锚定蛋白,gephyrin通过增加GABA受体的膜稳定性来增强抑制性突触的抑制功能。Gephyrin的功能受到亚硝化翻译后修饰的调控,gephyrin发生亚硝化修饰之后,其功能受到影响,对于GABA受体的膜稳定作用发生改变,提示gephyrin的亚硝化水平的变化有可能参与诱导焦虑样行为。但目前并不清楚gephyrin的亚硝化在焦虑症等神经精神疾病中扮演的角色及其分子机制。本研究拟采用大鼠的天然焦虑模型与慢性皮质酮暴露诱导的焦虑模型,探讨焦虑样大鼠基底外侧杏仁核(basolateral amygdala,BLA)脑区gephyrin亚硝化水平的变化,研究gephyrin亚硝化修饰水平在大鼠焦虑样行为中的作用。方法:使用大鼠天然高低焦虑模型以及慢性皮质酮暴露诱导的焦虑模型,通过高架十字迷宫(elevated plus maze,EPM)与旷场实验(open field test,OFT)评价大鼠的焦虑状态。运用western blot,酰基-生物素交换法(Acyl-biotinyl Exchange,ABE),生物素法等分子生物学方法检测大鼠不同焦虑状态下BLA脑区GABA_AR亚基的膜表达以及gephyrin亚硝化水平的变化。结果:通过EPM行为学将大鼠分为高焦虑鼠(high-anxiety,HA)和低焦虑鼠(low-anxiety,LA),HA鼠EPM开放臂运动运动时间(LA组:140.40±4.15 s,n=10;HA组:88.35±6.07 s,n=12,P0.0001)与运动距离(LA组:6.72±0.27 m,n=10;HA组:4.42±0.39m,n=12,P0.001)均明显减少,HA鼠与LA鼠总运动距离无显著性差异(LA组:12.64±0.52 m,n=10;HA组:11.98±1.08 m,n=12)。Western blotting实验发现HA鼠BLA脑区GABA_ARγ2膜表达减少(LA组:1.05±0.08,HA组:0.76±0.09,n=6,P0.05),两组大鼠GABA_ARγ2总蛋白表达无显著性差异(LA组:1.00±0.12,HA组:1.02±0.14,n=6);同时我们检测了GABA_ARα2,结果发现:GABA_ARα2膜蛋白与总蛋白表达均无显著性差异(GABA_ARα2膜蛋白:LA组:0.98±0.11,HA组:1.04±0.16,n=6;GABA_ARα2总蛋白:LA组:1.00±0.12,HA组:1.02±0.14,n=6)。HA鼠BLA脑区gephyrin亚硝化水平增加(LA组:0.74±0.08,HA组:0.98±0.04,n=6,P0.05)。为了更进一步说明gephyrin亚硝化水平与焦虑样行为之间的关系,采用慢性皮质酮暴露诱导的焦虑模型,对比溶剂组(vehicle,veh)皮质酮暴露组(corticosterone,cort)EPM检测中开放臂运动时间明显减少(Veh组:121.60±6.19 s,n=6;Cort组:51.94±9.58 s,n=8,P0.001);OFT检测中中央区的运动时间明显减少(Veh组:134.10±21.02 s,n=6;Cort组:23.64±3.45 s,n=8,P0.0001);OFT实验中运动总距离无显著性差异(Veh组:13.17±2.31 m,n=6;Cort组:14.00±1.68 m,n=8)。ABE法检测发现高焦虑大鼠BLA脑区gephyrin亚硝化水平增加(Veh组:0.94±0.10,n=6;Cort组:1.30±0.10,n=8,P0.05)。结论:高焦虑大鼠BLA脑区GABA_ARγ2的膜表达减少,gephyrin表达总量不变,其亚硝化水平增加。提示gephyrin的亚硝化修饰水平的变化可能参与诱导大鼠的焦虑样行为。第二部分基底外侧杏仁核gephyrin亚硝基化修饰诱导大鼠焦虑样行为的作用机制目的:作为中枢神经系统重要的酶,神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric-oxide synthase,nNOS)在中枢神经系统内可以产生一氧化氮(nitric oxide,NO)作为信号分子调控神经元活性,nNOS也可以通过蛋白的亚硝化修饰进而影响到下游信号。有研究表明nNOS可以调控大鼠焦虑样行为,本文第一部分研究发现gephyrin亚硝化修饰在高焦虑鼠中增加,并且也有报道:gephyrin可以发生亚硝化修饰。提示nNOS有可能介导了gephyrin亚硝化引起焦虑样行为的分子机制。为此,本文第二部分实验采用药理学和分子生物学方法调控nNOS,探讨其在gephyrin亚硝化修饰在大鼠焦虑样行为中的作用机制。方法:使用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CO-IP)实验检测nNOS与gephyrin之间是否存在相互作用,使用ABE法检测gephyrin的亚硝化水平,使用药理学手段通过nNOS特异性抑制剂7-硝基吲唑(7-Nitroindazole,7-NI)与钠离子通道特异性阻断剂河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)抑制nNOS活性,检测其对于gephyrin亚硝化水平的影响;分别使用慢病毒在BLA脑区过表达nNOS基因,或者系统给予nNOS的药理学抑制剂7-NI,然后通过EPM和OFT行为学评价小鼠的焦虑样行为的变化。结果:CO-IP实验发现在BLA脑区nNOS和gephyrin发生相互作用,离体孵育脑片给与SNAP,发现SNAP(1mM)增加gephyrin的亚硝化水平(Veh组:1.01±0.12,SNAP组:2.25±0.22,n=4,P0.01),进一步通过药理学手段使用TTX(30 uM)抑制nNOS活性,进而减少gephyrin的亚硝化水平(Veh组:1.65±0.08,TTX组:0.75±0.08,n=4,P0.001),使用甘氨酸(Glycine,Gly,200uM)通过NMDA受体激活nNOS,增加gephyrin亚硝化水平(Veh组:1.00±0.26,Gly组:1.65±0.18,n=4,P0.05);使用nNOS特异性抑制剂7-NI(100uM)取消Gly对于nNOS的激活作用,减少gephyrin的亚硝化水平(Gly组:1.65±0.19,Gly+7-NI组:1.07±0.19,n=4,P0.05);在BLA脑区特异性过表达nNOS(LV-GFP组:0.48±0.02;LV-nNOS组:0.57±0.01,n=8,P0.01)之后,EPM检测发现LV-nNOS组开放臂运动时间(LV-GFP组:146.30±20.78 s,LV-nNOS组:84.48±4.68 s,n=8,P0.05)与运动距离(LV-GFP组:4.20±0.55 m,LV-nNOS组:2.56±0.23 m,n=8,P0.05)均显著性降低;而运动总距离(LV-GFP组:7.60±0.54 m,LV-nNOS组:9.09±0.58 m,n=8)与运动平均速度(LV-GFP组:0.02±0.001m/s,LV-nNOS组:0.030±0.001 m/s,n=8)无显著性差异;同样,OFT的检测结果表明:过表达nNOS明显减少大鼠中央区的运动时间(LV-GFP组:47.21±8.34 s,LV-nNOS组:17.99±3.27 s,n=8,P0.05),OFT运动总距离无显著性差异(LV-GFP组:14.27±0.87 m,LV-nNOS组:13.51±1.83 m,n=8),这说明过表达nNOS可以诱导大鼠的焦虑样行为;使用nNOS的特异性抑制剂7-NI抑制nNOS活性之后,明显增加开放臂进入次数(Veh组:4.88±0.63,7-NI组:7.77±0.69,n=10,P0.05)、开放臂运动运动时间(Veh组:60.56±13.05 s,7-NI组:99.37±9.69 s,n=10,P0.05)、显著增加中央区穿梭次数(Veh组:7.66±0.97,7-NI组:12.40±1.74,n=10,P0.05)。结论:nNOS与gephyrin在BLA脑区发生相互作用,并且nNOS参与诱导大鼠焦虑样行为。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R749.72
【文章目录】：缩略词表（abbreviations）
中文摘要
Abstract
前言
第一部分 基底外侧杏仁核gephyrin亚硝基化修饰在大鼠焦虑样行为中的作用
材料和方法
结果
讨论
小结
第二部分 基底外侧杏仁核gephyrin亚硝基化修饰诱导大鼠焦虑样行为的作用机制
材料和方法
结果
讨论
小结
全文总结
本文的创新点
展望
参考文献
综述:Gephyrin在中枢的功能以及其与神经系统疾病的关系
参考文献
攻读硕士学位期间已发表的论文
致谢
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2883629
